检测核酸片段剪接情况的高通量基因芯片及其制备方法技术

本发明专利技术属于医学检验和基因芯片领域，提供了检测核酸片段剪接情况的高通量基因芯片及其制备方法；基因芯片的应用方法为样本RNA经过反转录得到双链cDNA，再用体外转录的方式得到cRNA并加上荧光标记，再将其与芯片上的探针杂交，根据设计芯片时的探针位置和荧光强度分布比对分析得出样本剪接情况。相对于现有的全外显子/全基因组检测，本发明专利技术所需要的检测成本和数据处理难度都有了大幅度的下降。本和数据处理难度都有了大幅度的下降。本和数据处理难度都有了大幅度的下降。

【技术实现步骤摘要】
检测核酸片段剪接情况的高通量基因芯片及其制备方法


[0001]本专利技术属于医学检验和基因芯片领域，具体涉及一种检测核酸片段剪接情况的高通量基因芯片及其制备方法。

技术介绍

[0002]RNA微阵列(RNA Microarrays)技术/基因芯片(Gene chip)技术是一种在上世纪80年代开始研制，90年代成熟和推广并得到广泛应用的生物学检测技术。
[0003]基因芯片用于定性或定量测量存在于生物体内的核酸；其基于固体基质(通常是载玻片或硅薄膜)上的二维阵列，其用于定性和定量的探针由数kb(cRNA芯片)或者几十个(寡核苷酸)特定类型的核苷酸所构成。基因芯片原理为碱基之间的互补配对作用，以及互补的核苷酸单链间的杂交作用。与传统的Southern杂交、Northern杂交等只能针对单个基因来分析的技术相比，基因芯片能够实现多个基因的共同检测，实现了基因检测的高通量。
[0004]基因编辑(Gene editing)一种改变细菌、植物和动物等“生物体基因组的特定目标基因,从而改变相应生物特征或治疗相关疾病的技术。目前，基因编辑技术主要包括锌指核酸酶(zinc
‑
finger nucleases,ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(tra nscription activator
‑
like effector nucleases,TALEN)和成簇规律性间隔短回文重复序列(clustered regularly intersp aced short palindromic repeats,CRISPR)等项技术。由于ZFN和TALEN的脱靶效应和组装的复杂性，故这两项基因编辑技术的应用受到了限制；而CRISPR的脱靶效应较少，并且它是基于RNA的一种编辑技术，更易于合成和并入靶细胞中，故目前已经成为了最常用的基因编辑技术。基因编辑能够治疗多种疾病，比如癌症、血液病、遗传性失明等。
[0005]RNA剪接(RNA splicing)是指从DNA模板链转录出的最初转录产物中除去内含子，并将外显子连接起来形成一个连续的RNA分子的过程。基因编辑将在基因中引发突变，该突变将对机体自身RNA剪接产生影响：
[0006]1.基因不表达。
[0007]2.不受基因编辑影响的核酸功能片段，即编辑部分在剪接过程中缺失。
[0008]3.利用乱码后RNA形成新的核酸功能片段。
[0009]目前对于基因突变的检测，最常用的是高通量的第一代或第二代全基因组测序；但此种方法有两个较大的缺陷，第一个是费用高昂；第二个是全基因组测序只能测量高表达量的基因；而通常对人体有害的基因(患病基因)往往是非野生型基因，其表达量通常很低；即全基因组测序对表达量低的基因有歧视；而基因剪接导致的基因突变均为突变型基因，全基因组测序对此类突变无对应检测能力。

技术实现思路

[0010]针对现有方法中难以检测由于基因剪接引起的突变所表达的未知蛋白质，提供一种高通量基因芯片、其制备方法和使用方法。
[0011]本专利技术的第一个目的为提供一种检测核酸片段剪接情况的高通量基因芯片的制备方法，所述基因芯片包括片基，该片基上设有探针；所述探针按照以下原则设计：
[0012]在基因序列上，根据GT
‑
AG法则，前体RNA中参与内含子剪接的两个特殊位点，即在内含子和外显子交界处有两个相当短的保守序列:5'端为GT,3'端为AG,通过计算机程序分析待研究的基因序列，并标记出所有的GT和AG序列，取GT往5
’
端一定长度的序列(例：5
’‑
ACTTACC
……
GGCCGT
‑3’
)和AG往3
‘
端一定长度的序列(例：5
’‑
AGTATCG
……
CCTATT)；
[0013]将分析出的GT相关序列作为探针始端序列，AG相关序列作为探针末端序列进行组合设计为探针(例：5
’‑
ACTTACC
……
GGCCTATCG
……
CCTATT
‑3’
)并置于基因芯片上。
[0014]优选地，GT往5
’
端的序列和AG往3
‘
端的序列的长度均为≤30bp。
[0015]本专利技术的第二个目的是提供上述检测核酸片段剪接情况的高通量基因芯片，
[0016]所述基因芯片包括片基，该片基上设有探针；所述探针按照以下原则设计：
[0017]在基因序列上，根据GT
‑
AG规则，通过计算机程序分析待研究的基因序列，取GT往5
’
端一定长度的序列和AG往3
‘
端一定长度的序列；
[0018]将分析出的GT和AG相关序列进行任意组合设计成探针。
[0019]本专利技术的第三个目的是提供上述检测核酸片段剪接情况的高通量基因芯片的使用方法，包括以下步骤：
[0020](1)样本RNA经过反转录得到双链cDNA；
[0021](2)双链cDNA以体外转录的方式得到cRNA并加上荧光标记；
[0022](3)带有荧光标记的cRNA与基因芯片；
[0023](4)根据基因芯片的探针位置和荧光强度分布比对分析得出样本剪接情况。
[0024]本专利技术的关键点在于基因芯片中探针组的选择，由于本专利技术是针对于基因剪切所带来的意料之外核酸功能片段的检测方法；所以探针检测的是剪接位点区的基因情况；更具体而言，如图1所示，生物体内基因的表达过程，从DNA到蛋白，也就是从遗传物质到功能结构。这是中心法则的一部分。其中DNA转录后的RNA，需要在剪接酶的作用下将内含子(黑线)切除，将外显子(彩色方框)连接到一起形成核酸功能片段，该功能片段经过进一步的修饰，将变成mRNA。关于核酸功能片段中外显子的接合机制还不太清楚，目前更像一个随机的过程。因此，最后能够翻译出数个不同的蛋白。
[0025]依照现有的机制，基因编辑，将破坏某个外显子的功能，影响基因的表达。但现在也有研究者发现，基因编辑某个基因位点之后，该基因的表达并未受到较大影响，甚至表达出了新的蛋白物质。造成这个的原因可能是在剪接环节，通过剪接产生了不受基因编辑影响(去掉编辑部分)的核酸功能片段或者利用乱码后RNA形成新的核酸功能片段；如图2所示。
[0026]由于剪接后片段的接合目前认为是一个相对随机的过程，专利技术则通过基因芯片来识别片段接合的情况，尤其是能识别到一些表达丰度可能较低的新功能核酸片段；如图3所示。
[0027]本专利技术的有益效果：
[0028]本专利技术设计出一种可以检测核酸片段剪接情况的高通量剪接芯片。能对基因无歧视的的筛查；无论患病(突变)基因是野生型基因还是突变型基因，均能同等对待的检测。同时本专利技术设计的高通量基因芯片能够快速方便的检测；相对于现有的全外显子/全基因组
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测核酸片段剪接情况的高通量基因芯片的制备方法，其特征在于，所述基因芯片包括片基，该片基上设有探针；所述探针按照以下原则设计：在基因序列上，根据GT
‑
AG法则，前体RNA中参与内含子剪接的两个特殊位点，通过计算机程序分析待研究的基因序列，并标记出所有的GT和AG序列，取GT往5
’
端一定长度的序列和AG往3
‘
端一定长度的序列；将分析出的GT相关序列作为探针始端序列，AG相关序列作为探针末端序列进行组合设计为探针并置于基因芯片上。2.根据权利要求1所述的检测核酸片段剪接情况的高通量基因芯片的制备方法，其特征在于，GT往5
’
端的序列和AG往3
‘
端的序列的长度均为≤30bp...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋清，马丽，
申请(专利权)人：广州鸿溪见杉科技有限公司，
类型：发明
国别省市：