一种检测信号通路相关基因RNA表达的基因芯片及其使用方法技术

本发明专利技术涉及一种检测信号通路相关基因RNA表达的基因芯片及其使用方法，其特点是将待测mRNA序列信号转移到探针的延伸链中进行标定与检测，提高了检出信号的信噪比，同时利用核酸聚合酶增强对序列配对准确性的校验。本发明专利技术适用于信号通路中各基因的表达状况的分析检测，尤其是多条信号通路之间的相互作用。尤其是多条信号通路之间的相互作用。

【技术实现步骤摘要】
一种检测信号通路相关基因RNA表达的基因芯片及其使用方法


[0001]本专利技术涉及生物芯片领域，特别涉及一种检测信号通路相关基因RNA表达的基因芯片及其使用方法。

技术介绍

[0002]生物芯片技术已经广泛应用于临床疾病诊断、健康管理、药物研究开发、动植物检疫、食品检测、环境监测、科学研究、法医学检测等众多领域，有广阔的应用前景，市场需求量非常大。基因芯片是生物芯片中的一类，是通过在芯片的基片上定植一系列的序列已知探针而制备，可用于特定标记核酸的杂交检测，能通过识别检测与信息处理来报告检测对象中核酸信息。
[0003]在当前的基因芯片检测中，基因芯片主要是通过探针与标记目标序列的杂交完成，仅仅是通过碱基互补配对完成验证选择，缺少更多的检查机制，容易造成假阳性或假阴性。由于杂交信息是通过碱基互补配对结合在探针上，结合能力弱，强化洗涤会造成假阴性；洗涤不足容易造成假阳性。
[0004]信号通路中相关基因的表达是生命科学与医学研究的重要内容，生命的生老病死都是信号通路的作用结果，了解信号通路中相关基因的表达水平对于了解生命规律、对于构建大健康产业都具有重要意义。利用基因芯片研究信号通路具有独特的优势，不仅仅是一次的研究基因数量大，更重要的是只有同时监测信号通路中基因表达变化才能有效确定信号通路之间的相互作用，多个独立研究很难揭示信号通路相关的生命机制。增强基因芯片检出的准确性、提高基因芯片检测的信噪比是基因芯片产业迫切需要解决的难题。

技术实现思路

[0005]本专利技术为解决现有技术中存在不足，在基因芯片上进行样品扩增有效防止目标序列的缺失影响，利用核酸聚合酶检验序列互补配对的准确性而提升基因芯片检测的准确度，通过把目标mRNA信息转移到探针延伸链中的方式把待检测信息固化到基因芯片上（延伸的探针代表阳性信号）而不会出现因为洗涤造成假阴性。
[0006]本专利技术的专利技术构思是：利用核酸聚合酶强化对碱基互补配对的检验来提高基因芯片检测的准确性，利用基因芯片上的RT
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PCR反应把目标mRNA信息转移到探针的延伸链中有效提高信噪比加强基因芯片检测的准确性。
[0007]为解决上述问题，本专利技术的技术方案如下：一种检测信号通路相关基因RNA表达的基因芯片及其使用方法，包括以下步骤：S1将特定信号通路中的所有相关基因按其表达的成熟mRNA序列选取与优化探针；S2将探针固定在基片上，保证探针序列都通过连接臂与基片连接，连接臂仅增加探针的空间自由度并不参与识别与结合；S3将纯化的总RNA加入到基因芯片中，并在基因芯片上组装RT
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PCR反应体系，每个
RT
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PCR反应中的一对引物均由基因芯片上固定的探针与oligo
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dT组成，反应底物中有一种底物为标记dNTP；S4在RT
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PCR过程中，oligo
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dT是过量的，所有成熟mRNA都可利用oligo
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dT为引物合成互补链（cDNA第一链），当基因芯片上的探针与cDNA第一链配对结合时，聚合酶以基因芯片上的探针为引物合成cDNA第二链，此过程即为3'
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RACE（快速扩增cDNA末端技术），固定在基因芯片的基片上的探针延伸过程也是标记dNTP进入探针延伸链的过程；利用探针与oligo
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dT配合，可以完成靶标mRNA的3'末端扩增；如果cDNA第一链不能与基因芯片上的所有探针配对，则该cDNA第一链无法完成3'
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RACE（快速扩增cDNA末端技术），不能通过聚合酶作用下的探针延伸反应进行探针的标记dNTP标记；S5通过清洗去除所有RT
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PCR反应组分及所有未与基片连接的核酸链，与延伸的探针链配对的非固定在基片上的核酸链也通过变性后洗脱的方法去除，基因芯片上只保留未反应的探针及完成延伸反应的探针，且标记dNTP已经整合在探针延伸链中；S6利用click反应完成对标记dNTP的最终可检测标记基团修饰（形成可检测的阳性信号），进行基因芯片的信号识别检测并形成检测结果。
[0008]优选的，利用核酸聚合酶完成序列配对正确性的校验，在碱基互补配对杂交检测的基础上增加了酶法检测有效提升检测的准确性。
[0009]优选的，把待检测样品的扩增步骤与检测步骤整合在一起，避免样品扩增步骤丢失信号物质而造成的假阴性。
[0010]优选的，利用RT
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PCR选择扩增特点保证只有探针序列与成熟mRNA序列一致才能有效延伸。
[0011]优选的，利用RT
‑
PCR选择扩增特点将成熟mRNA信息转变为特定探针延伸链中的标记dNTP特征。
[0012]优选的，最终检测体系中仅仅保留发生延伸反应的探针，没有其他核酸组分，有效提高信噪比。
[0013]优选的，标记的dNTP优选利用Click反应完成标记的dNTP的最终修饰。
[0014]优选的，标记dNTP的最终修饰是荧光基团标记，或是酶标记，或是量子点标记。
[0015]与现有技术相比，本专利技术利用核酸聚合酶增强对碱基互补配对的正确性的检测，通过在基因芯片上进行RT
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PCR扩增将待检测的特定信号通路中相关基因表达的成熟mRNA信息转变为特定探针的延伸能够提高检出信号的信噪比，能够有效在一张基因芯片上同时检测多条信号通路中的基因表达状况，用于研究信号通路之间的相互作用。
具体实施方式
[0016]下面通过具体实施例对本专利技术作进一步详述。以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本专利技术的保护范围。本专利技术所应用的化学试剂以及仪器如未经特别说明，均可从商业渠道购买。
[0017]实施例1一种检测信号通路RNA表达的基因芯片及其使用方法，包括以下步骤：S1将选定的目标信号通路（表皮生长因子通路）中相关基因按其表达的成熟mRNA序列选取与优化探针，利用化学法合成带有连接臂的目标探针；
S2通过由3个乙二醇分子组成的连接臂将合成的探针按设定位置连接在玻璃基片上，连接臂仅增加探针的空间自由度并不参与识别与结合；S3对待测样品进行总RNA提取，将总RNA加入到基因芯片中，并在基因芯片上组装RT
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PCR反应体系，加入反转录酶（M
‑
MLV）、高保真的DNA聚合酶（pfu），四种底物中有标记dCTP（含有可进行click反应的炔基），引物只有oligo
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dT；S4在RT
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PCR过程中，探针作为一个引物与oligo
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dT配合形成一对引物完成对于特定信号通路中相关基因表达的成熟mRNA的指数型扩增（2
n
），快速将特定信号通路中相关基因表达的成熟mRNA信息转移到探针的延伸链中；不能与探针结合的成熟mRNA及其oligo
‑
dT扩增产物在后继的清洗中去除；S5清洗基因芯片，将所有参与RT...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测信号通路相关基因RNA表达的基因芯片及其使用方法，其特征在于，包括以下步骤：S1将特定信号通路中的所有相关基因按其表达的成熟mRNA序列选取与优化探针；S2将探针固定在基片上，保证探针序列都通过连接臂与基片连接，连接臂仅增加探针的空间自由度并不参与识别与结合；S3将纯化的总RNA加入到基因芯片中，并在基因芯片上组装RT
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PCR反应体系，每个RT
‑
PCR反应中的一对引物均由基因芯片上固定的探针与oligo
‑
dT组成，反应底物中有一种底物为标记dNTP；S4在RT
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PCR过程中，oligo
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dT是过量的，所有成熟mRNA都可利用oligo
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dT为引物合成互补链（cDNA第一链），当基因芯片上的探针与cDNA第一链配对结合时，聚合酶以基因芯片上的探针为引物合成cDNA第二链，此过程即为3'
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RACE（快速扩增cDNA末端技术），固定在基因芯片的基片上的探针延伸过程也是标记dNTP进入探针延伸链的过程；利用探针与oligo
‑
dT配合，可以完成靶标mRNA的3'末端扩增；如果cDNA第一链不能与基因芯片上的所有探针配对，则该cDNA第一链无法完成3'
‑
RACE（快速扩增cDNA末端技术），不能通过聚合酶作用下的探针延伸反应进行探针的标记dNTP标记；S5通过清洗去除所有RT
‑
PCR反应组分及所有未与基片连接的核酸链，与延伸的探针链配对的非固定在基片上的核酸链也通过变性后洗脱的方法去除，基因芯片上只保留未反应的探针及完成延伸反应的探针，且标...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙宁，
申请(专利权)人：北京华牛世纪生物技术研究院，
类型：发明
国别省市：