酶法靶序列随机sgRNA文库的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种酶法靶序列随机sgRNA文库的制备方法，其特征在于其步骤包括：采用随机切口酶Nt.CviPII对样本DNA目标序列的PAM区域进行切口；含BbsI酶切位点的接头磁珠连接片段化的DNA；BbsI切割释放DNA；随机引物延伸；连接含MmeI酶切位点的sgRNA骨架；MmeI切割释放原间隔区域；连接T7启动子序列；扩增获得含T7启动子的sgRNA文库模板；体外转录获得sgRNA文库。本发明专利技术的酶法靶序列随机sgRNA文库的制备方法，可以一次性制备随机覆盖目标区域的所有sgRNA组，具有成本低、制作简单、覆盖均一、偏好性小、不受靶序列长度限制和无需大批量设计sgRNA等优点，在靶基因的捕获和去除上具有重要的应用价值。要的应用价值。要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
酶法靶序列随机sgRNA文库的制备方法


[0001]本专利技术专利涉及一种酶法靶序列随机sgRNA文库的制备方法，属于生物


技术介绍

[0002]CRISPR基因编辑技术自从被开发出来就被广泛应用在基因治疗、体外诊断、基因捕获和靶基因去除等各个领域，并获得2020年诺贝尔生理医学奖，是一种高效且实用的技术。实用型CRISPR系统主要有两个部分组成，一个是具有两个核酸内切酶活性位点的Cas蛋白，负责切割靶位点DNA的两条链；另一个是具有与靶位点处DNA配对序列和Cas蛋白结合序列的引导RNA(sgRNA)，负责募集Cas蛋白并引导Cas蛋白结合到互补配对的靶位点上。在CRISPR系统中，Cas蛋白先与sgRNA结合形成Cas
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sgRNA复合物，并在DNA上进行检索。当检索到与sgRNA互补配对的区域(原间隔区域，ProtoSpacer)，并且ProtoSpacer区域的3
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端存在NGG序列(PAM序列)时，Cas蛋白将靶位点进行解旋，使得解开的双链DNA进入到Cas蛋白的DNA切割活性结构域，Ca本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酶法靶序列随机sgRNA文库的制备方法，其特征在于其步骤包括：(1)采用随机切口酶Nt.CviPII处理样本DNA，Nt.CviPII对目标序列的PAM区域进行切口获得片段化的双链DNA，对双链DNA进行变性处理，获得片段化的单链DNA；(2)在步骤(1)的反应体系中加入含BbsI酶切位点的接头磁珠，接头的3
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端连接片段化的单链DNA；(3)将磁珠连接的DNA采用BbsI酶切割，释放出单链DNA；(4)随机引物延伸，使单链DNA形成双链DNA；(5)在双链DNA的3
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端连接含有MmeI酶切位点的sgRNA骨架；(6)采用MmeI切割步骤(5)的连接产物，释放原间隔区域；(7)在原间隔区域的5
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端连接T7启动子序列；(8)扩增获得含T7启动子的sgRNA文库模板；(9)体外转录获得sgRNA文库。2.根据权利要求1所述的酶法靶序列随机sgRNA文库的制备方法，其特征在于：所述样本DNA为基因组DNA、PCR产物或者DNA文库。3.根据权利要求1所述的酶法靶序列随机sgRNA文库的制备方法，其特征为：步骤(2)中接头磁珠的接头正向序列为/biotin/
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TTTTTGAAGA，反向序列为/NH2C6/
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NNNNNNNHGGTCTTCAAAAA
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/NH2C6/，两个序列在等摩尔浓度下进行退火，磁珠为链亲和霉素磁珠。4.根据权利要求3所述的酶法靶序列随机sgRNA文库的制备方法，其特征为：步骤(2)中采用T4 DNA连接酶或者E.coli DNA连接酶将片段化的DNA连接到接头上。5.根据权利要求1所述的酶法靶序列随机sgRNA文库的制备方法，其特征为：步骤(4)的随机引物为6碱基随机引物，延伸...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋东亮，刘倩，黄成，侯策，王嫚，孙睿，江翱，陈晶晶，曹振，
申请(专利权)人：翌圣生物科技上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：