一种一锅法合成基因编码β-内酰胺化合物库的方法技术

本发明专利技术提供了一种由寡聚核酸

【技术实现步骤摘要】
一种一锅法合成基因编码
β
‑
内酰胺化合物库的方法


[0001]本专利技术属于基因编码化合物库
，具体涉及将“一锅法”合成寡聚核酸
‑
β
‑
内酰胺的合成策略应用于基因编码化合物库构建的方法。

技术介绍

[0002]药物研发依赖于多种生物筛选方法来发现先导化合物
[1]。阿斯利康的科学家对2016～2017年间的66个临床候选药物的起源分析发现：43％的临床候选药物是基于已知活性的化合物、内源性配体或以前项目的研究基础发现的。29％是通过高通量筛选方法发现的
[2]。高通量筛选方法是发现先导化合物的重要方法，特别是对未知标靶蛋白配体的发现。剩下的筛选方法包括基于结构的药物设计
[3](Structure
‑
based drug design，简称SBDD；14％)、针对性的筛选(Focused Screening；8％)、基于片段化合物而进行的先导化合物的发现(FBLG；5％)
[4]以及基因编码库筛选(DELT；1％)。SBDD是根据目标蛋白质的3D结构特征，依赖于计算机算法指导小分子化合物结构设计与筛选，是发现先导化合物的一个重要途经
[5
‑
6]。在新型药物的研发过程中，科学家们不断地寻求更多有效的筛选方法，以便在众多化合物中，以无差异性的筛选方式，通过对生物学靶标的结合亲和力和/或药理学效力差异找到优异的活性化合物。高度自动化以及深度优化后的多种高通量筛选法在活性化合物的发现中的重要作用是无可争议的。但是，其高成本、较少的收录化合物总数、有限的化学空间结构以及生物筛选方法上的局限性越来越不能满足新药研发的需求
[7]。在很多疾病蛋白的筛选实践中，用这种传统方法是徒劳无功的。为了能突破高通量筛选方法的瓶颈，使筛选的化合物在数量及化学空间结构上呈现几何级数上的飞跃，以及同时使用多种生物筛选模式，基因编码化合物库技术(DELT)应运而生
[8]。
[0003]Brenner和Lerner于1992年提出DELT原创理论，并预见了它能够使用比传统化学更快捷的方式来合成和筛选数量庞大的编码化合物库
[9]。与传统高通量筛选相比，基因编码化合物库(DEL)极大地增加了化合物的数量和化学空间结构的多样性
[10]。在很小的体积例如几十微升的反应管中，通过一系列反应，可以合成上千万甚至上亿种不同的化合物
[11]。DELT的原理是用不同特定序列的基因片段来标记反应过程中的每一个小分子化合物。用组合化学的策略，通过使用拆分、合并(split and pool)的方法，利用有限的成本和时间，大量合成百万级至百亿级连接有特定基因序列标记过的化合物文库
[12]。然后将所得化合物的混合物与蛋白质靶标一起孵育，再通过洗去没有与靶标蛋白质结合的化合物而达到物理分离并找到具有高亲和力的化合物
[13]。孵育靶标蛋白质所需的基因编码化合物库只需极小的剂量(微克)，而且可以在很短时间内(比如1天内)进行。可以轻松地在不同条件下
[14](例如，溶液的酸碱度、样品蛋白混合方式、不同的蛋白质浓度、存在或不存在竞争化合物、存在不同的缓冲液或辅助因子等等)同时进行多项生物筛选实验。由于基因序列与化合物结构一一对应，通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，简称PCR)扩增和下一代测序(Next Generation Sequencing，简称NGS)读取后，就可以通过基因序列解码得到活性化合物的化学结构式。进而对具有高亲和力化合物进行“脱离寡聚核酸”的单独合
成，并逐个测定没有附着寡聚核酸的化合物与目标蛋白质的结合力以确认其生物活性
[15]。这种生物筛选方式与传统的高通量生物活性筛选中标靶蛋白与单个化合物逐一地进行是根本不同的。
[0004]最近几年在这一领域里出现的活细胞DEL筛选方法，是一个引人注目的成就
[16
‑
17]。它代表着通过DELT平台可以筛选到有细胞生物活性的化合物。DEL活细胞筛选将不再需要纯化过的靶标蛋白，也无需对蛋白进行修饰。这样不仅简化了生物筛选的过程，而且更好地保持了蛋白的原生态结构。因此，药物学家能够在此平台上找到更好的先导化合物
[18]。尽管DELT平台只有简短的发展历史，但它已经得到了广泛认可与应用，正积极地影响新药研发的进程。
[0005]构建化学结构上的多样性是DELT能够成功地筛选到有生物活性化合物的重要原因之一。通过传统的有机化学反应合成一些结构新颖的母核化合物，然后将母核化合物链接到寡聚核酸上，以此构建编码库是许多DEL的合成策略。此外，还可以直接在寡聚核酸上发现、发展新化学反应，特别是发展多组分化学反应(Multi
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component reaction)并用于DEL库的合成
[19]。通过多组分化学反应一步地合成基因编码库，这样既省时省力，又减少了化学反应对寡聚核酸不可逆转的损伤。鉴于这项工作的重要性，开发在DELT上应用的有机化学反应是我们工作的重要内容。
[0006]β
‑
内酰胺是一类重要的化合物。青霉素衍生物(penams)、头孢菌素和头霉素(cephems)、单内酰胺类、碳青霉烯类和碳头孢烯类化合物是β
‑
内酰胺化合物的典型代表
[20]。
[0007]自十九世纪二十年代亚历山大
·
弗莱明在寻找一种抗葡萄球菌噬菌体开始，β
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内酰胺类抗生素的出现彻底改变了人类与细菌传染病作斗争的局面。β
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内酰胺类抗生素是三大类抗生素之一。β
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内酰胺是过去60年间治疗由多种细菌引起的细菌感染最成功的药物物种。β
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内酰胺类抗生素是最常用的处方药之一。据统计，目前这些抗生素的年支出约为150亿美元，占抗生素市场总量的65％
[21
‑
22]。
[0008]从药物的构效关系来看，这些药物有一个共同的特点，就是具有高化学反应活性的3
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碳1
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氮环(β
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内酰胺环)化学结构。
[0009]根据我们掌握的文献资料表明，目前没有在寡聚核酸上合成β
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内酰胺环的报道。如果能够合成β
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内酰胺化合物DEL，它将是有科学理论价值、社会经济效益的研究。

技术实现思路

[0010]本专利技术所要解决的技术问题在于，提供了一种“一锅法”将寡聚核酸
‑
β
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内酰胺的合成策略应用于基因编码化合物库构建的方法。该方法普适性好、操作简单、条件温和，能高效率地实现基因编码β
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内酰胺化合物库的构建，为丰富基因编码β
‑
内酰胺化合物库分子的多样性提供了一条快捷实用的有效途径。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种“一锅法”合成基因编码β
‑
内酰胺化合物库的方法，包括以X种经特定序列的寡聚核苷酸链(TagA)标记的寡聚核酸
‑
末端炔烃的混合物为底物，在铜催化下，分别与Y种硝酮类试剂反应转化为寡聚核酸
‑
β
‑
内酰胺，然后再分别以特定序列的寡聚核苷酸链(TagB)标记，得到(X种
×
Y种)TagA
‑
TagB标记的寡聚核酸
‑
β
‑
内酰胺的混合物；其反应方程式如下：其中，所述结构式中的寡聚核酸是经人工修饰的或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链，其中链的长度没有限制；其中，所述的经特定序列的寡聚核苷酸链(TagA)标记的寡聚核酸
‑
末端炔烃化合物的结构式为：其中，结构式中R1为氢、氨基、硝基、氰基、羟基、巯基、芳基甲酮、烷基甲酮、C1‑
C
12
烷基、C1‑
C6烯烃基、C3‑
C8环烷基、C1‑
C6烷基氧、芳基、杂环芳基、卤素、羧基、酯基中的任意一种至多种或它们的任意组合；优选地，所述卤素选自氟、氯、溴和碘中的一种；其中，结构式中的TagA是已知序列的经人工修饰的或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的寡聚核苷酸链，其中链的长度没有限制；其中，所述TagB是已知序列的经人工修饰的或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的寡聚核苷酸链，其中链的长度没有限制；其中，所述硝酮结构为：其中，结构式中Ar1为五元、六元或更大的芳香环或芳香杂环；其中，结构式中Ar2为五元、六元或更大的芳香环或芳香杂环；其中，所述硝酮可以是纯的化合物也可以是原位生成的反应粗产品；其中，所述X理论上为任意正整数；其中，所述Y理论上为任意正整数。2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述经特定序列的寡聚核苷酸链(TagA)标记的寡聚核酸
‑
末端炔烃混合物的摩尔浓度是0.1～2毫摩尔/升；优选地，经特定序列的寡聚核苷酸链(TagA)标记后的寡聚核酸
‑
末端炔烃混合物的摩尔浓度为0.5～1.5毫摩尔/升；更优选地，经特定序列的寡聚核苷酸链(TagA)标记的寡聚核酸
‑
末端炔烃混合物的摩尔浓度为1.0毫摩尔/升。3.根据权利要求1的方法，其特征在于，以1当量的经特定序列的寡聚核苷酸链(TagA)标记后的寡聚核酸
‑
末端炔烃为参照，所述硝酮的用量为1～500当量；优选地，硝酮的用量
为1～100当量；更优选地，硝酮的用量为50当量。4.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述反应在碱的存在下进行，所述碱为碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸锂、氢氧化锂、氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化铯、硼酸钠、硼酸钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钾、醋酸钠、氟化钠、氟化钾、氟化铯、甲胺、乙胺、丙胺、异丙胺、N,N
‑
二乙胺、三乙胺、正丁胺、异丁胺、4
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二甲氨基吡啶、N,N
‑
二异丙基乙胺、1,8
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二氮杂二环[5.4.0]十一碳
‑7‑
烯、N,N,N',N'
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四甲基乙二胺、四甲基胍、吡啶、N
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甲基二环己胺或二环己胺中的一种或几种的混合；优选地，所述碱为四甲基胍、N
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甲基二环己胺或二环己胺中的一种或几种的混合；更优选地，所述碱为N,N
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二环己基甲胺。5.根据权利要求4的方法，其特征在于，以1当量的经特定序列的寡聚核苷酸链(...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡允金，罗阿云，张子琪，杨珂新，汪秀明，
申请(专利权)人：康龙化成北京新药技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：