构建DNA文库的方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种文库构建方法及试剂盒。其中，该方法包括对dsDNA片段进行末端修复及3'端加A反应，获得加A产物；将加A产物与接头连接，获得连接产物；其中，末端修复及加A反应缓冲液含有8

【技术实现步骤摘要】
构建DNA文库的方法及试剂盒


[0001]本专利技术涉及基因测序领域，具体地，涉及一种文库构建方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]无创产前DNA检测，是一种针对胎儿染色体非整倍性疾病的新型检测技术，具有无创、可靠、便捷、快速的特点，发病率较高的21-三体综合征(唐氏综合征)、18-三体综合征(爱德华氏综合征)、13-三体综合征(帕陶氏综合征)均在检测范围内。
[0003]1997年，科学家发现在母体外周血中存在胎儿游离DNA，这一发现成为了无创产前检测的理论基础。无创产前DNA检测技术通过采集孕妇外周血，利用二代测序技术对母体外周血中的游离DNA片段进行测序，并结合生物信息分析及数据统计，最终评估胎儿是否患21-三体综合征(唐氏综合征)、18-三体综合征(爱德华氏综合征)、13-三体综合征(帕陶氏综合征)三大染色体疾病。
[0004]二代测序文库的构建一般流程如下：对目的DNA片段化；对游离DNA进行末端平齐化处理；在平齐化后的DNA的3
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末端突出腺苷酸化；将突出腺苷酸化的DNA片段与突出胸腺嘧啶化的双链Y型接头进行连接；通常文库构建末端修复、3'端加A反应、加接头，每一步反应结束都需要分离纯化，步骤繁琐，样本需要量大，反应需要的酶多。文库构建的时间长，酶的用量大，建库成本高。
[0005]因此，文库的构建方法有待改进。

技术实现思路

[0006]本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种文库构建方法，该方法通过提高缓冲液的兼容性，适用于文库构建过程中的末端修复及3'端加A反应两步反应，无需纯化，简化了建库流程，降低了反应时间，并且，建库所需样本量低。
[0007]根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种构建DNA文库的方法。根据本专利技术的实施例，该方法包括：对dsDNA片段进行末端修复及3'端加A(腺苷酸)反应，获得加A产物；将加A产物与接头连接，获得连接产物；其中，末端修复及加A反应缓冲液含有8-12mM Tris-HCl、1-2mM MgCl2和45-55mM KCl，且pH值为8-10。
[0008]根据本专利技术实施例的构建DNA文库的方法，通过提高缓冲液的兼容性，适用于文库构建过程中的末端修复及3'端加A反应两步反应，无需纯化，简化了建库流程，降低了反应时间，有利于提高构建DNA文库的方法的效率和稳定性。并且，该缓冲液对建库反应的酶无明显的抑制作用，降低了酶的用量，减少了建库所需酶的种类，此外，建库过程样本损失少，仅需微量样本即可实现建库。
[0009]根据本专利技术的实施例，所述末端修复及加A反应缓冲液含有9-11mM Tris-HCl、1.3-1.8mM MgCl2、48-52mM KCl，且pH值为8.5-9.5。
[0010]根据本专利技术的实施例，所述末端修复及3'端加A反应的反应条件为：37℃5～30分
钟、65℃10～30分钟。
[0011]根据本专利技术的实施例，所述末端修复及3'端加A反应的反应条件为：37℃10分钟、65℃20分钟。
[0012]根据本专利技术的实施例，dsDNA片段不低于4ng。
[0013]根据本专利技术的实施例，所述dsDNA为血浆游离DNA。
[0014]根据本专利技术的实施例，利用聚合酶进行所述3'端加A反应，且所述聚合酶为无5
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外切酶活性的聚合酶。
[0015]根据本专利技术的实施例，所述聚合酶为Klenow exo酶或HemoKlen Taq酶。
[0016]根据本专利技术的实施例，所述3'端加A反应的所述聚合酶的用量为0.2-0.5U/μL，优先地，为0.3U/μL。
[0017]根据本专利技术的实施例，所述dsDNA为打断的DNA片段。
[0018]根据本专利技术的实施例，所述末端修复和3'端加A反应是连续进行的。
[0019]根据本专利技术的实施例，所述接头连接的接头浓度为4-40pmol，纯化倍数为1.0倍。
[0020]根据本专利技术的另一方面，本专利技术提供了一种构建文库的试剂盒。根据本专利技术的实施例，该试剂盒包括：末端修复及3'端加A反应缓冲液，所述缓冲液包括：8-12mM Tris-HCl、1-2mM MgCl2和45-55mM KCl，且pH值为8-10；连接缓冲液；以及末端修复及3'端加A反应控件，所述末端修复及3'端加A反应控件的控制条件是37℃5～30分钟、65℃10～30分钟。
[0021]根据本专利技术实施例的试剂盒，采用具有高兼容性的缓冲液，适用于文库构建过程中的末端修复及3'端加A反应两步反应，无需纯化，简化了建库流程，降低了反应时间，并且，该构建DNA文库的试剂盒的建库效率和稳定性高。此外，该缓冲液对建库反应的酶无明显的抑制作用，降低了酶的用量，减少了建库所需酶的种类，降低了试剂盒的成本，此外，该试剂盒建库过程样本损失少，仅需微量样本即可实现建库。
[0022]根据本专利技术的实施例，该试剂盒进一步包括：无5
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外切酶活性的聚合酶。
[0023]根据本专利技术的实施例，所述聚合酶为Klenow exo酶或HemoKlen Taq酶。
[0024]根据本专利技术的实施例，所述末端修复及3'端加A反应缓冲液包括9-11mM Tris-HCl、1.3-1.8mM MgCl2、48-52mM KCl，且pH值为8.5-9.5。
[0025]本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。
具体实施方式
[0026]下面的实施例是示例性的，仅用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。
[0027]需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本专利技术的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
[0028]构建DNA文库的方法
[0029]根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种构建DNA文库的方法。根据本专利技术实施例的构建DNA文库的方法，通过提高缓冲液的兼容性，适用于文库构建过程中的末端修复及3'端加A反应两步反应，无需纯化，简化了建库流程，降低了反应时间，并且，该缓冲液对建
库反应的酶无明显的抑制作用，降低了酶的用量，减少了建库所需酶的种类，此外，建库过程样本损失少，仅需微量样本即可实现建库，根据本专利技术的一些实施例，仅需4ng即可实现建库。
[0030]S100末修加A
[0031]根据本专利技术的实施例，对dsDNA片段进行末端修复及3'端加A反应，获得加A产物，其中，该末端修复及3'端加A反应所需的末端修复及加A反应缓冲液含有8-12mM Tris-HCl、1-2mM MgCl2和45-55mM KCl，且pH值为8-10。
[0032本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建DNA文库的方法，其特征在于，包括：对dsDNA片段进行末端修复及3'端加A反应，获得加A产物；以及将加A产物与接头连接，获得连接产物；其中，末端修复及加A反应缓冲液含有8-12mM Tris-HCl、1-2mM MgCl2和45-55mM KCl，且pH值为8-10。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述末端修复及加A反应缓冲液含有9-11mM Tris-HCl、1.3-1.8mM MgCl2和48-52mM KCl，且pH值为8.5-9.5。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述末端修复及3'端加A反应的反应条件为：35-40℃5～30分钟、60-70℃10～30分钟，任选地，所述末端修复及3'端加A反应的反应条件为：37℃10分钟、65℃20分钟。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述dsDNA片段不低于4ng。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述dsDNA为血浆游离DNA。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，利用聚合酶进行所述3'端加A反应，且所述聚合酶为无5
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外切酶活性的聚合酶，任选地，所述聚合酶为Klenow exo酶或H...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱穆真，姜锋，程世月，陈雪，李志民，孙雪光，王娟，李卓芮，
申请(专利权)人：安诺优达基因科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：