一种基于启动子构建文库的方法及其文库技术

一种基于启动子构建文库的方法及其文库。该方法包括：打断步骤，包括对待测样本进行打断处理，获得打断后的待测样本；酶促甲基化转化步骤，包括对打断后的待测样本进行酶促甲基化转化；T7启动子连接步骤，包括将酶促甲基化转化处理后的待测样本与T7启动子退火，反应得到连接有T7启动子的待测样本；体外转录步骤，包括将连接有T7启动子的待测样本转录为RNA；反转录及扩增步骤，包括对RNA进行反转录、PCR扩增，获得文库。相比于现有技术中直接做PCR，本发明专利技术中T7的转录(针对富含尿嘧啶的DNA)更加均一，转录能获得较多的RNA作为下一步cDNA扩增的模板，极大地提升了甲基化的覆盖度。极大地提升了甲基化的覆盖度。极大地提升了甲基化的覆盖度。

【技术实现步骤摘要】
一种基于启动子构建文库的方法及其文库


[0001]本专利技术涉及基因测序
，具体涉及一种基于启动子构建文库的方法及其文库。

技术介绍

[0002]近年来，单细胞测序技术的快速发展为复杂的生物系统提供了许多有价值的见解，例如，揭示复杂和罕见的细胞群体，跟踪不同细胞谱系的发展轨迹。目前有许多单细胞测序方法，其中最流行的是常规的单细胞RNA或DNA测序。除了RNA和DNA信息外，表观遗传修饰是指在不改变DNA序列本身的情况下，在遗传物质中引起可遗传表型的变化。在这些表观遗传修饰中，5
‑
甲基胞嘧啶(5
‑
methylcytosine,5mC)是脊椎动物中最丰富的修饰基，已成为调控胚胎发育、基因组印迹、X失活、细胞分化和增殖的重要研究课题。
[0003]目前主要针对5mC的单细胞测序技术，从策略上主要分为：1、传统的先建库后亚硫酸氢盐处理(Pre
‑
BS)；2、亚硫酸氢盐处理后再建库(post
‑
bisulfite adaptor tagging，PBAT)。基于PBAT策略的技术，有以下几种：scBS
‑
seq、scWGBS、snmC
‑
seq(基于单细胞核的DN A甲基化测序研究)。其中Smallwood的scBS
‑
seq技术检测到位点数最多，能检测到3700万个CpG位点。此外，最近的进展促进了高通量的单细胞甲基化测序。甲基化分析的单细胞组合索引(sci
‑
MET)使用带索引的转座子标记单细胞，然后在亚硫酸氢盐转换后随机启动标记另一个接头。虽然这些方法提高了接头的连接效率，但在亚硫酸氢盐的严酷处理中，它们都存在DNA降解的问题。最近报道了一种温和的转化方法TAPS，利用高浓度的TET1将5mC转化为5CaC，再用碳酸氢盐将5CaC转化为尿嘧啶。然而，这种TET1并不适用于大多数实验室。综上所述，单细胞甲基化测序的覆盖率较低，仅达到20％的CpG，不到10％的基因组。这就需要提高单细胞的覆盖范围和准确性、读取长度。

技术实现思路

[0004]根据第一方面，在一实施例中，提供一种基于启动子构建文库的方法，包括：
[0005]打断步骤，包括对待测样本进行打断处理，获得打断后的待测样本；
[0006]酶促甲基化转化步骤，包括对打断后的待测样本进行酶促甲基化转化，使非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶；
[0007]T7启动子连接步骤，包括将酶促甲基化转化处理后的待测样本与T7启动子退火，反应得到连接有T7启动子的待测样本；
[0008]体外转录步骤，包括将所述连接有T7启动子的待测样本转录为RNA；
[0009]反转录及扩增步骤，包括对所述RNA进行反转录、PCR扩增，获得文库，即为可用于上机测序的文库。
[0010]根据第二方面，提供第一方面所述方法构建得到的文库。
[0011]根据第三方面，在一实施例中，提供由第二方面所述的文库上机测序所获得的测序数据。
[0012]依据上述实施例的一种基于启动子构建文库的方法及其文库，相比于现有技术中直接做PCR，本专利技术中T7的转录(针对富含尿嘧啶的DNA)更加均一，转录能获得较多的RNA作为下一步cDNA扩增的模板，更均一地获得了大量的DNA模板，极大地提升了甲基化的覆盖度。
附图说明
[0013]图1为实施例1的建库流程示意图。
[0014]图2为T7体外转录后的RNA片段测试结果图。
[0015]图3为PCR产物测试结果图。
[0016]图4为4号染色体的C/CG/CHG(100bp bin)覆盖度结果图。
[0017]图5为4号染色体6500000
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7000000区域的GC覆盖度结果图。
[0018]图6为CGI覆盖度结果图。
[0019]图7为TEAM
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seq(20pg/100pg)和WGBS(1μg)之间的甲基化状态一致性(甲基化/未甲基化)结果图。
[0020]图8为单细胞CpG/CHG/CHH覆盖度结果图。
[0021]图9为单细胞基因组覆盖度结果图。
具体实施方式
[0022]下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
[0023]另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
[0024]本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。而本申请所说“连接”、“联接，”如无特别说明，均包括直接和间接连接(联接)。
[0025]术语解释
[0026]scBS
‑
seq：Single
‑
Cell Bisulfite Sequencing，亚硫酸氢盐单细胞测序。
[0027]scPBAT：Single
‑
Cell Post
‑
Bisulfite Adaptor Tagging，单细胞
‑
后亚硫酸氢盐适配器标签。
[0028]scWGBS：Single
‑
Cell Whole Genome Bisulfite Sequencing，亚硫酸氢盐单细胞全基因组测序。
[0029]snmc
‑
seq：single nucleus methylcytosine sequencing，单核甲基胞嘧啶测序。
[0030]sci
‑
MET：single
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cell combinatorial indexing for methylation analysis单细胞组合索引的甲基化分析。
[0031]TAPS:TET
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assisted pyridine borane sequencing，tet辅助的吡啶硼烷测序。
[0032]TEAM
‑
seq：T7
‑
assisted enzymatic m本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于启动子构建文库的方法，包括：打断步骤，包括对待测样本进行打断处理，获得打断后的待测样本；酶促甲基化转化步骤，包括对打断后的待测样本进行酶促甲基化转化，使非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶；T7启动子连接步骤，包括将酶促甲基化转化处理后的待测样本与T7启动子退火，反应得到连接有T7启动子的待测样本；体外转录步骤，包括将所述连接有T7启动子的待测样本转录为RNA；反转录及扩增步骤，包括对所述RNA进行反转录、PCR扩增，获得所述文库。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述T7启动子连接步骤中，退火反应条件如下：95～98℃，1～3min；55～65℃，1～3min；25～40℃，1～5min。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述T7启动子连接步骤中，退火结束后，将退火后的待测样本与dNTP以及DNA聚合酶混合反应，得到反应后的待测样本。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，将退火后的待测样本与dNTP以及DNA聚合酶混合反应时，反应条件如下：30～37℃，15～25min；65～75℃，10～20min。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，T7启动子连接步骤结束后，不进行纯化，直接进行体外转录。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，打断步骤中，使用酶对待测样本进行打断；优选地，所述酶包括Tn5转...

【专利技术属性】
技术研发人员：王娟，唐冲，
申请(专利权)人：深圳华大基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：