本发明专利技术属于基因工程高通量测序技术领域，公开了一种16S rDNA文库构建方法、16S rDNA文库及应用，所述16S rDNA文库构建方法包括：DNA片段末端修复；特定接头连接；PCR扩增。本发明专利技术提供的16S rDNA文库构建方法，以illumina为代表的二代测序技术可以使成本大大降低，适合大规模测序。本发明专利技术16S rDNA建库实质就是利用酶和引物对特定区域进行PCR富集和筛选，这种建库方法相对机器打断法等方法来说成本较低。16S rDNA既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，目前被广泛用于病原菌的检测和鉴定。本发明专利技术中的16SrDNA建库方法经过多次实验后得到的建库体系可达到有效节省建库时间和成本。有效节省建库时间和成本。有效节省建库时间和成本。
【技术实现步骤摘要】
一种16S rDNA文库构建方法、16S rDNA文库及应用
[0001]本专利技术属于基因工程高通量测序
，尤其涉及一种16S rDNA文库构建方法、16S rDNA文库及应用。
技术介绍
[0002]目前，随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol％、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16S rDNA序列分析等。细菌中包括三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA。rRNA基因由保守区和可变区组成。16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，仅几十bp，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分子量太大，分析较困难。而16S rRNA相对分子量在2kb左右，较为适合PCR扩增，又具有保守性和存在普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此普遍采用16S rRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。16S rRNA的编码基因是16S rDNA，直接提取16S rRNA较困难易被广泛存在的RNase降解，因而利用16S rDNA鉴定细菌。但现有技术中关于16S rDNA文库构建的方法尚未见报道。因此，亟需一种新的16S rDNA文库构建方法。
[0003]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
[0004](1)5S rRNA核苷酸太少，仅几十bp，没有足够的遗传信息用于分类研究。
[0005](2)23S rRNA含有的核苷酸数是16S rRNA的两倍，分子量大，分析困难。
[0006](3)现有技术中关于16S rDNA文库构建的方法尚未见报道。
[0007]解决以上问题及缺陷的难度为：由于5S rRNA核苷酸太少，没有足够的遗传信息可用于分类研究，所以5S rRNA不做分析；研究表明23S rRNA的分子量大，其在细菌诊断中的优越性高于16S rRNA，更适合临床常见致病微生物的鉴别诊断，但在临床标本中，设计针对多种细菌的引物进行多重PCR反应往往会引起非特异反应。
[0008]解决以上问题及缺陷的意义为：16S rRNA测序可以用于肠道微生物的研究，因此找到一种16S rRNA的文库构建方法是重中之重，便于研究肠道微生物对于如肥胖、糖尿病和心脑血管疾病等慢性病的影响，可以确定肠道微生物的生成和稳定机制。
技术实现思路
[0009]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种16S rDNA文库构建方法、16S rDNA文库及应用，尤其涉及一种基于illumina测序平台适用于16S rDNA文库构建方法。
[0010]本专利技术是这样实现的，一种16S rDNA文库构建方法，所述16S rDNA文库构建方法包括以下步骤：
[0011]步骤一，DNA片段末端修复：将DNA片段进行末端修复并在5
’
端进行磷酸化和向3
’
端末尾加上腺嘌呤尾巴；末端修补的目的是将损坏的或不完全的DNA末端修复成5
’
磷酸化的平头末端DNA，以用于平末端DNA连接。
[0012]步骤二，特定接头连接：将步骤一中的末端修复产物连接上Adapter；接头主要是为了测序，接头上含有测序引物互补结合的片段序列，通过和测序引物结合来对目的片段进行测序。
[0013]步骤三，PCR扩增：将步骤二中的接头连接产物进行PCR扩增，形成测序文库。后续上机测序且用双端Iindex拆分出各个样本。
[0014]进一步，步骤一中，所述DNA片段末端修复的试剂，包括DNA模板和末端修复酶混合液End Prep Mix4。
[0015]进一步，步骤一中，所述DNA片段末端修复的仪器为：PCR基因扩增仪。
[0016]进一步，步骤一中，所述DNA片段末端修复的方法，包括：
[0017]根据末端修复反应体系将末端修复酶混合液加入DNA模板中震荡混匀瞬时离心；放入已设好末端修复程序的PCR基因扩增仪中运行程序。
[0018]进一步，步骤二中，所述特定接头连接的试剂，包括末端修复产物、快速连接缓冲液Rapid Ligation Buffer、快速连接酶Rapid DNA Ligase以及特定接头Adapter。
[0019]进一步，步骤二中，所述特定接头连接的仪器为：PCR基因扩增仪。
[0020]进一步，步骤二中，所述特定接头连接的方法，包括：
[0021](1)根据接头连接反应体系将Rapid Ligation Buffer、Rapid DNA Ligase、Adapter配置成MIX后加入末端修复产物中震荡混匀瞬时离心；
[0022](2)放入已设好接头连接程序的PCR基因扩增仪中运行程序；
[0023](3)反应结束加入Clean Beads，充分结合后上磁力架吸附磁珠，弃上清并用新鲜配置的80％乙醇纯化两次后，加入洗脱液洗脱出磁珠内的接头连接产物。
[0024]进一步，步骤三中，所述PCR扩增的试剂，包括接头连接产物、Hifi Amplification Mix以及双端Index接头引物。
[0025]进一步，步骤三中，所述PCR扩增的仪器为：PCR基因扩增仪。
[0026]进一步，步骤三中，所述PCR扩增的方法，包括：
[0027](1)根据PCR扩增反应体系将Hifi Amplification Mix加入接头连接产物，单独加入双端Index接头引物至混合液中震荡混匀瞬时离心；
[0028](2)放入已设好PCR扩增程序的PCR基因扩增仪中运行程序；
[0029](3)反应结束加入Clean Beads，充分结合后上磁力架吸附磁珠，弃上清并用新鲜配置的80％乙醇纯化两次后，加入洗脱液洗脱出磁珠内的PCR产物；
[0030](4)质量控制：PCR产物可使用凝胶电泳、Ailgent生物分析仪或Qsep100检测长度分布是否合格或使用荧光染料法Qubit4.0测定文库浓度是否合格；
[0031](5)实验结果：如后续进行测序实验，PCR直接按照测序流程进行实验；如后续不进行测序实验，将PCR产物于4℃稳定保存一周；长期保存置于
‑
20℃，避免不必要的反复冻融。
[0032]本专利技术的另一目的在于提供一种由所述16S rDNA文库构建方法构建的16S rDNA文库。
[0033]本专利技术的另一目的在于提供一种病原菌的检测和鉴定方法，所述病原菌的检测和鉴定方法使用所述的16S rDNA文库。
[0034]结合上述的所有技术方案，本专利技术所具备的优点及积极效果为：
[0035]微生物测序研究常用手段包括16S等扩增子测序和宏基因组测序，这两者技术手
段的主要区别如下：
[0036]一、测序原理不同：16S rDN本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种16S rDNA文库构建方法，其特征在于，所述16S rDNA文库构建方法包括以下步骤：步骤一，DNA片段末端修复：将DNA片段进行末端修复并在5
’
端进行磷酸化和向3
’
端末尾加上腺嘌呤尾巴；步骤二，特定接头连接：将步骤一中的末端修复产物连接上Adapter；步骤三，PCR扩增：将步骤二中的接头连接产物进行PCR扩增，形成测序文库。2.如权利要求1所述的16S rDNA文库构建方法，其特征在于，步骤一中，所述DNA片段末端修复的试剂，包括DNA模板和末端修复酶混合液End Prep Mix4。3.如权利要求1所述的16S rDNA文库构建方法，其特征在于，步骤一中，所述DNA片段末端修复的仪器为：PCR基因扩增仪。4.如权利要求1所述的16S rDNA文库构建方法，其特征在于，步骤一中，所述DNA片段末端修复的方法，包括：根据末端修复反应体系将末端修复酶混合液加入DNA模板中震荡混匀瞬时离心；放入已设好末端修复程序的PCR基因扩增仪中运行程序。5.如权利要求1所述的16S rDNA文库构建方法，其特征在于，步骤二中，所述特定接头连接的试剂，包括末端修复产物、快速连接缓冲液Rapid Ligation Buffer、快速连接酶Rapid DNA Ligase以及特定接头Adapter。6.如权利要求1所述的16S rDNA文库构建方法，其特征在于，步骤二中，所述特定接头连接的仪器为：PCR基因扩增仪。7.如权利要求1所述的16S rDNA文库构建方法，其特征在于，步骤二中，所述特定接头连接的方法，包括：(1)根据接头连接反应体系将Rapid Ligation Buffer、Rapid DNA Ligase...
【专利技术属性】
技术研发人员：祁凡百，张嘉桐，赵国军，刘律文，
申请(专利权)人：上海长为数据技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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