质粒测序方法技术

本发明专利技术设计利用多标签接头和/或引物对大规模质粒进行TN5建库的方法和组合物。所述方法包括(1)使用多种转座体复合物对多种质粒进行片段化处理，(2)任选的混合多种质粒的片段和纯化，(3)使用第一连接引物和第二连接引物对片段化产物进行扩增，(4)使用含有测序接头的第三引物和第四引物对步骤(3)的扩增产物进行扩增，和任选的(5)对步骤(4)的扩增产物进行纯化。纯化。

【技术实现步骤摘要】
质粒测序方法


[0001]本专利技术涉及测序方法，具体涉及大规模、高通量质粒测序方法。

技术介绍

[0002]质粒(Plasmid)是细菌等微生物染色体之外的一种环形的、裸露的双链DNA分子，其长度从1kb至1000kb不等(Doghaither and Gull,2019)。质粒在二十世纪四五十年代被陆续发现，并于1952年由Joshua Lederberg统一其命名(Lederberg,1952)。随着DNA限制性内切酶、连接酶等DNA操作工具的发现，1973年，Stanley N.Cohen及其同事开启了体外重组质粒并利用其作为遗传操作工具的历史(Cohen et al.,1973)。从此，质粒成为了基因克隆和表达的基础工具，并被广泛应用于生物学、生态学、农业、医学等相关领域。
[0003]从结构上看，质粒序列一般可分为两部分，即骨架和插入序列。骨架一般包含复制子、抗生素抗性基因等用于在质粒扩增中进行复制和筛选的元件，以及启动子、增强子、终止子等基因表达元件。这部分序列在不同的质粒中相对固定，可根据转化细菌、表达细胞的不同以及筛选需要等进行一些有限的选择。插入序列是指实现质粒特殊功能的元件，一般是蛋白或RNA的编码基因。这部分序列根据具体需求可插入不同序列，几乎没有限制，因此其序列在不同的质粒中是高度多样的。
[0004]作为一种基础工具，质粒被广泛使用，并在不同的科研团队、商业公司中分享和传播。广泛的分享与传播也为质粒的准确性带来了一些问题。一、骨架上可能存在突变。鉴于质粒骨架序列相对固定，许多质粒在构建之初，其骨架序列并未被完全鉴定，通常仅插入序列被测序鉴定。然而，由于一些骨架被长期的大量使用，而DNA的复制并非绝对准确，部分质粒骨架或已累积未知的突变。二、插入序列不详。质粒在多个团队间分享传播过程中难以避免的会出现信息缺失或混淆，这导致部分质粒的插入序列信息不详，或信息与实际质粒不匹配。上述问题表明了质粒在分享传播过程中进行质粒序列再鉴定的重要性。通常质粒序列的再鉴定可以通过对质粒进行测序来解决。对于单个质粒，通常使用桑格测序通过逐段设计引物进行测序，然后拼接以获得质粒的完整序列。但是该法费用较高，一般每个质粒需要几十至数百元人民币；且该法通量低，只能逐个测序，每个质粒又需多次测序；针对未知序列的质粒，该法更为繁琐，需先设法获取部分序列，如构建特定片段到已知质粒载体上并测序，再逐步设计引物测序，周期漫长，耗费颇多。当需要进行大量质粒的再鉴定时，桑格测序已难以胜任。鉴于此，我们使用转座酶Tn5对每个质粒进行打断并标记，然后借助高通量测序技术可大量并行测序的能力，建立了一种可同时检测数百至上千个质粒的测序方法，以实现低成本、高通量、快速简便的质粒序列再鉴定。

技术实现思路

[0005]本专利技术涉及用于处理多种质粒的方法、组合物和试剂盒，尤其是使用转座体复合物将质粒断裂和加标签的方法和组合物。
[0006]本专利技术提供一种多质粒TN5建库方法，其特征在于，所述方法包括：
[0007](1)使用多种转座体复合物对多种质粒进行片段化处理，其中所述多种转座体复合物包含TN5转座酶和含多种核酸序列的多种核酸分子，所述多种核酸序列包含转座子末端序列和多种标签序列，所述多种转座体复合物包含的多种标签序列不同，
[0008](2)任选的混合多种质粒的片段和纯化，
[0009](3)使用第一连接引物和第一连接引物对片段化产物进行扩增，
[0010](4)使用含有测序接头的第三和第四引物对步骤(3)的扩增产物进行扩增，和
[0011]任选的(5)对步骤(4)的扩增产物进行纯化。
[0012]在一个或多个实施方案中，所述方法包括：
[0013](1)使用多种转座体复合物对多种质粒进行片段化处理，其中
[0014](1.1)至少一种转座体复合物包含TN5转座酶和含第一核酸序列的至少第一核酸分子，和
[0015](1.2)至少一种转座体复合物包含TN5转座酶和含第二核酸序列的至少第二核酸分子，
[0016](2)任选的混合多种质粒的片段和纯化，
[0017](3)使用第一连接引物和第二连接引物对片段化产物进行扩增，
[0018](4)使用含有测序接头的第三引物和第四引物对步骤(3)的扩增产物进行扩增，和
[0019]任选的(5)对步骤(4)的扩增产物进行纯化，
[0020]其中，第一核酸序列包含第一转座子末端序列和第一标签序列，第二核酸序列包含第二转座子末端序列和第二标签序列，所述第一标签序列和第二标签序列不同。
[0021]在一个或多个实施方案中，(1)是使用多种转座体复合物对多种质粒分别进行片段化处理。
[0022]在一个或多个实施方案中，(1.1)的转座体复合物包含两种或更多种所述第一核酸分子，所述两种或更多种第一核酸分子的核酸序列中的第一标签序列彼此不同。
[0023]在一个或多个实施方案中，第一标签序列是NNNNNNNN，各N独立地为A、T、G或C。优选地，第一标签序列选自TATAGCCT、ATAGAGGC、TCGCCTTA、CTAGTACG、TTCTGCCT、GCTCAGGA、AGGAGTCC、CATGCCTA、GTAGAGAG、CCTCTCTG。
[0024]在一个或多个实施方案中，(1.2)的转座体复合物包含两种或更多种所述第二核酸分子，所述两种或更多种第二核酸分子的核酸序列中的第二标签序列彼此不同。
[0025]在一个或多个实施方案中，第二标签序列是NNNNNNNN，各N独立地为A、T、G或C。优选地，第二标签序列选自CGAGTAAT、TCTCCGGA、AGCGTAGC、CAGCCTCG、TGCCTCTT、TCCTCTAC、ATCACGAC、ACAGTGGT、CAGATCCA、ACAAACGG、ACCCAGCA、AACCCCTC、CCCAACCT、CACCACAC。
[0026]在一个或多个实施方案中，所述第一转座子末端序列和所述第二转座子末端序列不同或相同。
[0027]在一个或多个实施方案中，所述第一转座子末端序列和所述第二转座子末端序列中任一或二者是AGATGTGTATAAGAGACAG。
[0028]在一个或多个实施方案中，第一核酸序列的部分序列与第一连接引物的部分序列相同；第二核酸序列的部分序列与第二连接引物的部分序列相同。
[0029]在一个或多个实施方案中，第一连接引物的部分序列与含有测序接头的第三引物的部分序列相同；第二连接引物的部分序列与含有测序接头的第四引物的部分序列相同。
[0030]在一个或多个实施方案中，第一核酸序列的部分序列与第一连接引物的部分序列相同，所述第一连接引物还含有与含有测序接头的第三引物的部分序列相同的序列；第二核酸序列的部分序列与第二连接引物的部分序列相同，所述第二连接引物还含有与含有测序接头的第四引物的部分序列相同的序列。
[0031]在一个或多个实施方案中，测序接头包含第三标本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多质粒TN5建库方法，其特征在于，所述方法包括：(1)使用多种转座体复合物对多种质粒进行片段化处理，其中(1.1)至少一种转座体复合物包含TN5转座酶和含第一核酸序列的至少第一核酸分子，和(1.2)至少一种转座体复合物包含TN5转座酶和含第二核酸序列的至少第二核酸分子，(2)任选的混合多种质粒的片段和纯化，(3)使用第一连接引物和第二连接引物对片段化产物进行扩增，(4)使用含有测序接头的第三引物和第四引物对步骤(3)的扩增产物进行扩增，和任选的(5)对步骤(4)的扩增产物进行纯化，其中，所述第一核酸序列包含第一转座子末端序列和第一标签序列，所述第二核酸序列包含第二转座子末端序列和第二标签序列，所述第一标签序列和第二标签序列不同。优选地，(1.1)的转座体复合物包含两种或更多种所述第一核酸分子，所述两种或更多种第一核酸分子的核酸序列中的第一标签序列彼此不同；优选地，(1.2)的转座体复合物包含两种或更多种所述第二核酸分子，所述两种或更多种第二核酸分子的核酸序列中的第二标签序列彼此不同。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一标签序列是NNNNNNNN，各N独立地为A、T、G或C；优选地，所述第一标签序列选自TATAGCCT、ATAGAGGC、TCGCCTTA、CTAGTACG、TTCTGCCT、GCTCAGGA、AGGAGTCC、CATGCCTA、GTAGAGAG、CCTCTCTG，和/或所述第二标签序列是NNNNNNNN，各N独立地为A、T、G或C；优选地，所述第二标签序列选自CGAGTAAT、TCTCCGGA、AGCGTAGC、CAGCCTCG、TGCCTCTT、TCCTCTAC、ATCACGAC、ACAGTGGT、CAGATCCA、ACAAACGG、ACCCAGCA、AACCCCTC、CCCAACCT、CACCACAC，和/或所述第一转座子末端序列和所述第二转座子末端序列中任一或二者是AGATGTGTATAAGAGACAG。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述第一核酸序列的部分序列与所述第一连接引物的部分序列相同；所述第二核酸序列的部分序列与所述第二连接引物的部分序列相同，或所述第一连接引物的部分序列与含有测序接头的第三引物的部分序列相同；所述第二连接引物的部分序列与含有测序接头的第四引物的部分序列相同，或所述第一核酸序列的部分序列与所述第一连接引物的部分序列相同，所述第一连接引物还含有与含有测序接头的第三引物的部分序列相同的序列；所述第二核酸序列的部分序列与所述第二连接引物的部分序列相同，所述第二连接引物还含有与含有测序接头的第四引物的部分序列相同的序列。4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法具有选自以下一项或多项的特征：所述测序接头包含第三标签序列NNNNNN，各N独立地为A、T、G或C；优选地，第三标签序列选自TGCCGA、CTTCGA，所述第一核酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述第二核酸序列如SEQ ID NO:2所示，
所述第一连接引物如SEQ ID NO:3所示，所述第二连接引物如SEQ ID NO:4所示，所述第三引物如SEQ ID NO:5所示，所述第四引物如SEQ ID NO:6所示，所述方法还包括在(3)所述的扩增前的填充缺口和连接切口步骤，步骤(2)的纯化是纯化200bp至500bp的片段。5.由权利要求1或2所述的方法制备的质粒DNA文库。6.一种组合物，包含多种...

【专利技术属性】
技术研发人员：周水荣，孟飞龙，陈飞，牛志杰，钱韵婷，
申请(专利权)人：苏州中科细胞转化研究院，
类型：发明
国别省市：