一种装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞及其制备方法和应用。具体地，通过将工程改造的减毒沙门氏菌装载于单核细胞或巨噬细胞中，装载的细胞被招募至肿瘤微环境，有效避免了细菌脱靶至正常脏器中。细胞的包裹伪装也有效避免了细菌的过早暴露。其通过直接杀死肿瘤细胞或释放胞内工程菌以激活/调节免疫系统间接抑制肿瘤，而充当有效的免疫效应物。效应物。效应物。

Monocyte or macrophage loaded with attenuated Salmonella and its preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及一种装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]自19世纪末威廉
·
科利医生（ William Coley）尝试使用热灭活的革兰氏阳性细菌（链球菌）和革兰氏阴性细菌（粘质沙门氏菌）对肿瘤患者进行治疗以来，越来越多的微生物被开发与改造用于进行肿瘤的治疗（Coley WB，1991，Clinical Orthopaedics and Related Research，262(262):3
‑
11）。这些微生物，往往被称作“溶瘤菌”，包括沙门氏菌，李斯特菌，大肠杆菌，因其自身的兼性厌氧特性以及肿瘤微环境特有特征，包括肿瘤内部乏氧环境，免疫抑制环境和大量坏死细胞释放出的养料，而能够在注射给药后实现于肿瘤部位的高效定殖（Gurbatri CR，2020，Science Translational Medicine，12(530)；Zhou S，2018，Nature Reviews Cancer，18(12): 727
‑
743；Suh S，2019，Advanced Science，6(3): 1801309）。然而这类溶瘤菌因其自身毒性，往往也会导致机体不同程度的肝脾损伤。例如，VNP20009，一种鼠伤寒沙门氏菌的减毒株（以下简述为VNP），因其更低的毒性与临床前良好的抑瘤效果而受到广泛的关注（Clairmont C，2000，Journal of Infectious Diseases，181: 1996
‑
2002）。尽管通过两种基因（purI和msbB）的缺失实现了VNP较原沙门氏菌毒性的大幅降低，但在临床前小鼠实验中，借助VNP20009静脉或腹腔注射的抑瘤治疗仍会因为菌株在正常脏器中的存在与积累而带来一定程度的毒副作用，如肝脏损伤，脾脏肿大，小鼠体重骤降。虽然使用瘤内注射能够减轻这一损伤的发生（Chowdhry S，2019，Nature Medicine，25(7): 1057
‑
1063；Toso J F，2002，Journal of Clinical Oncology，20(1): 142
‑
152），但这无疑大大限制了微生物疗法的应用范围。在临床I期实验中，VNP展现出可喜的安全性，但在有效性上表现不佳（Toso J. F，2002，Journal of Clinical Oncology, 20(1):142
‑
152）。因此，如何进一步提高VNP溶瘤菌在体内的肿瘤靶向性及其肿瘤抑制效果是极具挑战性的问题。
[0003]近些年来，多种类型的白细胞，包括巨噬细胞、中性粒细胞，T细胞，因其对肿瘤区域独特的归巢效应而被用作有效的肿瘤药物递送载体（Xie Z，2017，Small，13(10) ；Xue J，2017，Nature Nanotechnology，12(7): 692
‑
700 ；Huang B，2015，Science Translational Medicine，7(291): 291ra94）。这类免疫细胞可以通过感知肿瘤相关趋化因子或细胞因子，如集落刺激因子1 (CSF
‑
1) 、肿瘤坏死因子(TNF)、趋化因子配体5（CCL5）的提示（Salmon H，2019，Nature Reviews Cancer，19(4): 215
‑
227），在穿过多种屏障后到达患者的肿瘤区域。而目前借助细胞递药的主要挑战之一在于，受限于单个细胞的载药量以及所需较高的有效治疗剂量，往往需要注射大量的细胞进行治疗（小鼠上需要10^7
‑
10^8级别）（Xue J，2017，Nature Nanotechnology，12(7): 692
‑
700；Huang B，2015，Science Translational Medicine，7(291): 291ra94），继而对应着复杂的操作手段与昂贵的治疗
费用。因此，如何改进以巨噬细胞为代表的细胞递药平台，实现细胞治疗的简便性、低剂量性、有效性，是研究人员不断探索的内容。

技术实现思路

[0004]本专利技术目的是针对目前的肿瘤治疗困境，提供了一种使用巨噬细胞免疫细胞作为减毒沙门氏菌载体进行肿瘤靶向治疗的技术，以实现1）减少单独注射减毒沙门氏菌因脱靶所致的毒副作用；2）避免减毒沙门氏菌的过早暴露而被迅速清除。最终提高减毒沙门氏菌在肿瘤内的滴度，并通过巨噬细胞与溶瘤菌的联用，提高肿瘤抑制效果。
[0005]为了解决现有技术的问题， 本专利技术提供了如下技术方案：本专利技术的一种装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞，其制备方法包括如下步骤：以巨噬细胞装载减毒沙门氏菌，所述的巨噬细胞为巨噬细胞系RAW264.7或腹腔及血液来源的原代巨噬细胞PEMF，所述的减毒沙门氏菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009及其衍生或基因改造菌株，肿瘤靶向性不发生改变，包括但不限于前述已经申请专利技术专利技术的各菌株（ZL201410209851.7，ZL201610946268.3，ZL201610945015.4，ZL201610945021.X，202010182038.0；Acta Pharmaceutica Sinica B 2021，11(10):31653177；phoP/phoQ）；菌株为不携带或携带表达治疗基因、示踪基因外源基因的表达质粒。
[0006]更进一步地，所述的减毒沙门氏菌为含有能表达治疗基因、示踪基因外源基因的表达质粒的减毒沙门氏菌及其衍生或基因改造菌株，所述的治疗基因为能够在减毒沙门氏菌表达的、具有治疗作用的蛋白质的编码基因，包括但不限于前述已经申请专利技术的细胞凋亡类抗肿瘤基因、血管生成抑制剂基因或免疫检查点阻断剂抗体基因（ZL201110360656.0；202111278413.2；202210011915.7；202210070594.8；202210181926.X；202210182870.X；202210182455.4；202210182222.4；Acta Pharmaceutica Sinica B 2021，11(10):31653177；Theranostics 2017, 7(8):2250
‑
2260；Sci Rep 2016, 21;6:34178；American Journal of Cancer Research 2015, 5(2):792
‑
801；Current Gene Therapy 2014, 14(2):75
‑
85；Mol Cell Proteomics. 2011，10(6):M111.009399；Cancer Biology & Therapy 2005，8(4):840
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞，其特征在于：以巨噬细胞装载减毒沙门氏菌，所述的巨噬细胞为巨噬细胞系RAW264.7或腹腔及血液来源的原代巨噬细胞，所述的减毒沙门氏菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009及其衍生或基因改造菌株，菌株为不携带或携带表达治疗基因、示踪基因外源基因的表达质粒。2.根据权利要求1所述的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞，其特征在于：所述的治疗基因为能够在减毒沙门氏菌表达的、具有治疗作用的蛋白质的编码基因，包括细胞凋亡类抗肿瘤基因、血管生成抑制剂基因或免疫检查点阻断剂抗体基因，所述的示踪基因为能够在减毒沙门氏菌表达荧光蛋白RFP或荧光素酶示踪蛋白LuxCDABE的基因，包括来源于绿色荧光蛋白GFP或红色荧光蛋白RFP及其衍生荧光蛋白的基因，所述的荧光素酶蛋白基因LuxCDABE的序列为SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；所述的荧光蛋白RFP的序列为SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞，其特征在于：所述的表达质粒上有在减毒沙门氏菌中常用的启动子，包括J23100组成型启动子、NirB启动子、adhE启动子或扩增SifB启动子环境影响的启动子；质粒上含有防质粒丢失元件AT；所述的扩增防质粒丢失元件AT的序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述的扩增SifB启动子PsifB的序列为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述的J23100组成型启动子的序列为SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；所述的PsifB 上游引物的序列为SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；所述的PsifB下游引物的序列为SEQ ID No.7所示的核苷酸序列。4.权利要求1所述的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的制备方法，其特征在于：将经25
‑
500 ng/mL LPS诱导处理4
‑
48小时的RAW264.7巨噬细胞系，或通过5%淀粉肉汤腹腔注射刺激2
‑
4天联合贴壁培养法纯化获得的原代单核细胞或巨噬细胞分别与减毒沙门氏菌以1:5
‑
1:100比例分别共培养30
‑
150分钟，然后用 50
‑
100
ꢀµ
g/mL 庆大霉素处理细胞 30
‑
60分钟以杀死细胞外细菌；使用稀释涂板计算巨噬细胞吞噬后活VNP的数量，以记录不同处理条件下胞内的有效装载菌株数目与细胞活性，并用于最终共培养时间的确定以及后续细胞实际给药剂量的计算。5.权利要求1所述的单核细胞或巨噬细胞的细菌装载效率和组织分布水平的评价和示踪方法，其特征在于包括如下步骤：单核细胞或巨噬细胞中装载能够表达或定量检测的荧光蛋白或荧光素酶示踪蛋白，包括可稳定组成型表达红色荧光RFP的VNP20009菌VNP
‑
RFP或表达荧光素酶LuxCDABE的VNP20009菌VNP
‑
LuxCDABE，评价和示踪装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的细菌装载效率和组织分布及水平；所述的示踪基因为能够在减毒沙门氏菌表达荧光蛋白RFP或荧光素酶示踪蛋白LuxCDABE的基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：华子春，吴乐阳，李霖，
申请(专利权)人：江苏靶标生物医药研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：