脂质纳米粒子的冻干组合物制造技术

提供一种能够高效且简便地封入任意核酸的冻干组合物。一种冻干组合物，其是脂质纳米粒子的冻干组合物，所述脂质纳米粒子不含核酸而包含离子性脂质、甾醇、PEG脂质、在pH1～6具有缓冲作用的酸性缓冲液成分及冷冻保护剂，其中，冷冻保护剂与总脂质的重量比为10:1～1000:1。1000:1。1000:1。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】脂质纳米粒子的冻干组合物


[0001]本专利技术涉及不含核酸的脂质纳米粒子的冻干组合物和使用该冻干组合物的包封核酸的脂质纳米粒子的制造方法。

技术介绍

[0002]为了将使用siRNA等寡核酸的核酸疗法、使用mRNA或pDNA的基因疗法投入实际应用，需要有效且安全的核酸递送载体。病毒载体是具有高表达效率的核酸递送载体，但正在开发可以更安全地使用的非病毒核酸递送载体。
[0003]由于使用具有季胺的阳离子性脂质的阳离子性脂质体带正电荷，因此它们可以与带负电荷的核酸通过静电相互作用形成脂质复合物(lipoplex)，从而可以将核酸递送至细胞内。此外，利用季胺与核酸发生静电相互作用，制备不含核酸的阳离子性脂质体的冻干组合物，并通过与核酸的水溶液进行再水合形成脂质复合物，因此也可以作为基因导入试剂使用(专利文献1、2)。
[0004]然而，通过这种方法制备成的脂质复合物难以控制粒径，并且来自带正电荷的阳离子脂质的细胞毒性成为问题。
[0005]因此，使用有在酸性条件下带正电荷且在中性附近不带电荷的在分子内具有叔胺的离子性脂质的脂质纳米离子(称为脂质纳米粒子(LipidNanoparticle)，或LNP)被开发，并且目前最通常使用的是使用非病毒核酸递送载体(非专利文献1)。
[0006]作为使用有分子内具有叔胺的离子性脂质的脂质纳米粒子，也有在离子性脂质中添加分解性基团的例子(专利文献3)。
[0007]如上所述，已经开发出各种非病毒载体，但核酸通常是不稳定的化合物，因此其作为制剂的稳定性仍然存在问题。
[0008]作为提高作为制剂的稳定性的方法之一，尝试将包封有核酸的脂质纳米粒子冻干，并在使用时进行再水合，以重构脂质纳米粒子(专利文献4和非专利文献2)。
[0009]虽然这些方法作为提高包封有特定核酸的脂质纳米粒子的保存稳定性的方法是有用的，但作为更简便地将任意核酸包封在脂质纳米粒子中的方法存在问题。
[0010]作为将任意核酸简便地包封在脂质纳米粒子中的方法，可以举出如专利文献1和2中记载的方法，制备不含核酸的冻干组合物，然后用核酸的水溶液进行再水合的方法。
[0011]但是，使用在分子内具有叔胺的离子性脂质得到的脂质纳米粒子，由于制备后的表面电荷为弱负性至中性，因此不与核酸发生静电相互作用，无法通过专利文献1和2中公开的不含核酸的冻干组合物后用核酸水溶液再水合的方法，制备核酸包封脂质纳米粒子。
[0012]如上所述，没有方法以高核酸包封率将任意核酸包封在脂质纳米粒子中。现有技术文献专利文献
[0013]专利文献1：日本专利第4919397号公报专利文献2：日本专利第4598908号公报
专利文献3：日本专利第6093710号公报专利文献4：国际公开第2017/218704号非专利文献
[0014]非专利文献1：GeneTherapy6:271
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281,1999非专利文献2：Biol.Pharm.Bull.41,1291
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1294(2018)

技术实现思路

专利技术所要解决的问题
[0015]本专利技术所要解决的问题是提供一种现有技术无法实现的可以高效且简便地包封任意核酸的冻干组合物，以及提供一种使用该冻干组合物的包封核酸的脂质纳米粒子的制造方法。解决问题的技术方案
[0016]本专利技术人鉴于上述问题，经过不懈努力，结果发现，在酸性缓冲液中制备不含核酸的脂质纳米粒，进一步加入冷冻保护剂进行冷冻干燥，然后用含有核酸的水溶液进行再水合，由此可以高效且简便地将任意核酸包封在脂质纳米粒子中。此外，使用通过该方法制备成的脂质纳米粒子，进行基因向细胞内导入实验，发现通过提高冻干前的冷冻保护剂的浓度，可以实现向细胞内均匀的基因导入，从而完成了本专利技术。
[0017]即，本专利技术包括以下内容：[1]一种冻干组合物，其是脂质纳米粒子的冻干组合物，该脂质纳米粒子的冻干组合物不含核酸而包含离子性脂质、甾醇、PEG脂质、在pH1～6具有缓冲作用的酸性缓冲液成分及冷冻保护剂，其中，冷冻保护剂与总脂质的重量比为10:1～1000:1。
[0018][2]根据[1]所述的冻干组合物，进一步包含磷脂。
[0019][3]根据[1]或[2]所述的冻干组合物，其中，冷冻保护剂与总脂质的重量比为30:1～1000:1。
[0020][4]根据[1]～[3]中任一项所述的冻干组合物，其中，冷冻保护剂的浓度以冻干前的组合物计为80～800mg/mL。
[0021][5]根据[1]～[4]中任一项所述的冻干组合物，其中，冷冻保护剂的浓度以冻干前的组合物计为160～800mg/mL。
[0022][6]根据[1]～[5]中任一项所述的冻干组合物，其中，离子性脂质是由式(1)表示的化合物：
[0023][化1][0024](式(1)中，R
1a
和R
1b
各自独立地表示碳原子数为1～6的亚烷基，X
a
和X
b
各自独立地表示碳原子数为1～6且叔氨基数为1的非环状烷基叔氨基，或碳
原子数为2～5且叔氨基数为1～2的环状亚烷基叔氨基，R
2a
和R
2b
各自独立地表示碳原子数为8以下的亚烷基或氧二亚烷基，Y
a
和Y
b
各自独立地表示酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键或脲键，Z
a
和Z
b
各自独立地表示由碳原子数为3～16且具有至少1个芳香环且任选地具有杂原子的芳香族化合物衍生的二价基团，R
3a
和R
3b
各自独立地表示来自具有羟基的脂溶性维生素与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基、或来自具有羟基的甾醇衍生物与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基、或碳原子数为12～22的脂肪族烃基)。
[0025][7]根据[1]～[6]中任一项所述的冻干组合物，其中，冷冻保护剂是二糖。
[0026][8]根据[1]～[6]中任一项所述的冻干组合物，其中，冷冻保护剂是蔗糖。
[0027][9]一种包封核酸的脂质纳米粒子的制造方法，其包括以下步骤：a)将包含离子性脂质、甾醇及PEG脂质的醇溶液与在pH1～6具有缓冲作用的酸性缓冲液混合，制备不含核酸的脂质纳米粒子悬浮液的步骤，b)将不含核酸的脂质纳米粒子悬浮液与冷冻保护剂混合，得到包含80～800mg/mL的冷冻保护剂且pH1～6的混合物的步骤，c)将步骤b得到的混合物冻干，得到冻干组合物的步骤，d)将冻干组合物与包含核酸且任选包含0～25v/v％的醇的水溶液混合，任选将混合物在0～95℃下温育0～60分钟，得到包封核酸的脂质纳米粒子的步骤，以及e)通过透析、超滤或稀释，将得到的包封核酸的脂质纳米粒的外水相更换为中性缓冲溶液的步骤。
[0028][10]根据[9]所述的方法，进一步包含如下步骤：在步骤a中，制备脂质纳米粒子悬浮本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种冻干组合物，其是脂质纳米粒子的冻干组合物，该脂质纳米粒子的冻干组合物不含核酸而包含离子性脂质、甾醇、PEG脂质、在pH1～6具有缓冲作用的酸性缓冲液成分及冷冻保护剂，其中，冷冻保护剂与总脂质的重量比为10:1～1000:1。2.根据权利要求1所述的冻干组合物，其进一步包含磷脂。3.根据权利要求1或2所述的冻干组合物，其中，冷冻保护剂与总脂质的重量比为30:1～1000:1。4.根据权利要求1～3中任一项所述的冻干组合物，其中，冷冻保护剂的浓度以冻干前的组合物计为80～800mg/mL。5.根据权利要求1～4中任一项所述的冻干组合物，其中，冷冻保护剂的浓度以冻干前的组合物计为160～800mg/mL。6.根据权利要求1～5中任一项所述的冻干组合物，其中，离子性脂质是由式(1)表示的化合物：[化1]式(1)中，R
1a
和R
1b
各自独立地表示碳原子数为1～6的亚烷基，X
a
和X
b
各自独立地表示碳原子数为1～6且叔氨基数为1的非环状烷基叔氨基，或碳原子数为2～5且叔氨基数为1～2的环状亚烷基叔氨基，R
2a
和R
2b
各自独立地表示碳原子数为8以下的亚烷基或氧二亚烷基，Y
a
和Y
b
各自独立地表示酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键或脲键，Z
a
和Z
b
各自独立地表示由碳原子数为3～16且具有至少1个芳香环且任选地具有杂原子的芳香族化合物衍生的二价基团，R
3a
和R
3b
各自独立地表示来自具有羟基的脂溶性维生素与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基、或来自具有羟基的甾醇衍生物与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基、或碳原子数为12～22的脂肪族烃基。7.根据权利要求1～6中任一项所述的冻干组合物，其中，冷冻保护剂是二糖。8.根据权利要求1～6中任一项所述的冻干组合物，其中，冷冻保护剂是蔗糖。9.一种包封核酸的脂质纳米粒子的制造方法，其包括以下步骤：a)将包含离子性脂质、甾醇及PEG脂质的醇溶液与在pH1～6具有缓冲作用的酸性缓冲液混合，制备不含核酸的脂质纳米粒子悬浮液的步骤，b)将不含核酸的脂质纳米粒子悬浮液与冷冻保护剂混合，得到包含80～800mg/mL的冷冻保护剂、pH1～6的混合物的步骤，c)将步骤b得到的混合物冻干，得到冻干组合物的步骤，d)将冻干组合物与包含核酸且任选包含0～25v/v％的醇的水溶液混合，任选将混合物
在0～95℃下温育0～60分钟，得到包封核酸的脂质纳米粒子的步骤，以及e)通过透析、超滤或稀释，将得到的包封核酸的脂质纳米粒的外水相更换为中性缓冲溶液的步骤。10.根据权利要求9所述的方法，其进一步包含如下步骤：在步骤a中，制备脂质纳米粒子悬浮液后，通过透析、超滤或稀释，将外水相更换为在pH1～6具有缓冲作用的其他酸性缓冲液。11.根据权利要求9或10所述的方法，其中，在步骤a中，醇溶液进一步包含磷脂。12.根据权利要求9～11中任一项所述的方法，其中，在步骤b中，混合物中的冷冻保护剂的浓度为160～800mg/mL。13.根据权利要求9～12中任一项所述的方法，其中，离子性脂质是式(1)表示的化合物：[化2]式(1)中，R
1a
和R
1b
各自独立地表示碳原子数为1～6的亚烷基，X
a
和X
b
各自独立地表示碳原子数为1～6且叔氨基数为1的非环状烷基叔氨基，或碳原子数为2～5且叔氨基数为1～2的环状亚烷基叔氨基，R
2a
和R
2b
各自独立地表示碳原子数为8以下的亚烷基或氧二亚烷基，Y
a
和Y
b
各自独立地表示酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键或脲键，Z
a
和Z
b
各自独立地表示由碳原子数为3～16且具有至少1个芳香环且任选地具有杂原子的芳香族化合物衍生的二价基团，R
3a
和R
3b
各自独立地表示来自具有羟基的脂溶性维生素与琥珀酸酐或戊二酸酐的反应物的残基、或来自具有羟基的甾醇衍生物与琥珀酸酐或戊...

【专利技术属性】
技术研发人员：丹下耕太，中井悠太，玉川晋也，种市樱，秋田英万，田中浩挥，白根大贵，萩原伸哉，
申请(专利权)人：国立大学法人千叶大学，
类型：发明
国别省市：