【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本申请中的公开涉及一种核酸序列改变用组合物及改变核酸序列的靶部位的方法。
技术介绍
1、近年来，在各种生物种中，作为改变基因组dna的靶部位的技术的基因组编辑备受关注。作为基因组编辑方法，例如已知有如下方法：(1)使用将锌指dna结合域(zinc fingerarray)与非特异性dna切割域(nuclease domain)连结而成的锌指核酸酶(zfn)，在dna中的靶基因座对宿主的植物细胞或昆虫细胞进行重组的方法(参照专利文献1、图1的a)；(2)使用将植物病原菌黄单胞菌属所具有的dna结合模块即转录激活因子样(tal)效应子与dna核酸内切酶(nuclease domain)连结而成的talen，在特定的核苷酸序列内或与其相邻的部位，对靶基因进行切割/修饰的方法(参照专利文献2、图1的b)。
2、然而，如图1的a所示，上述专利文献1中记载的方法需要两个对基因组dna进行识别的域(zinc finger array)，其分别由蛋白质形成。而且，对基因组dna进行识别的两个域分别被设计为从双链dna的靶部位识别3’侧。因此，在改变基因组dna的靶部位时，存在需要设计不同序列的一对锌指阵列(zinc finger array)的问题。
3、另外，如图1的b所示，上述专利文献2中记载的方法与专利文献1中记载的方法的不同点在于，对基因组dna进行识别的域(tal效应子)的方向是从双链dna的靶部位到5’侧。然而，与专利文献1所记载的方法同样地，在改变基因组dna的靶部位时，存在需要设计不同序列的一对tal效应
4、另一方面，作为改变基因组dna的靶部位的技术，近年来，crispr/cas9受到关注(参照专利文献3～6)。如图2所示，crispr/cas9由具有与想要改变的dna互补的序列的引导rna和与引导rna形成复合体的cas9蛋白质构成。crispr/cas9的引导rna只要仅识别双链dna的一方的链而形成互补对即可。因此，与上述专利文献1和2不同地，具有对改变基因组dna的靶部位的核酸酶域(nuclease domain)进行引导的引导rna为一个即可的优点。
5、在先技术文献
6、专利文献
7、专利文献1：日本专利第4968498号公报；
8、专利文献2：日本特表2013-513389号公报；
9、专利文献3：日本特表2015-527889号公报；
10、专利文献4：日本特表2016-500262号公报；
11、专利文献5：日本特表2016-501531号公报；
12、专利文献6：日本特表2016-501532号公报。
技术实现思路
1、专利技术要解决的问题
2、然而，在使用专利文献3～6中记载的crispr/cas9的方法中，如图2所示，基因组dna的pam序列(5’-ngg-3’等)的3～4碱基上游侧的碱基通过cas9核酸内切酶来切割。即，使用crispr/cas9的方法中存在基因组dna的靶部位被限制在pam序列附近的问题。另外，还已知有通过使用cas13来改变rna，但在该情况下，也存在靶部位被限制在pfs(protospacerflanking site，前间隔序列侧翼位点)序列附近的问题。
3、本申请中的公开是为了解决上述问题点而完成的，进行深入研究的结果新发现，通过使用(1)包含杂交区域和识别区域的rna、以及(2)与识别区域形成复合体的融合蛋白质，能够不依赖于pam序列、pfs序列地改变核酸序列。即，本申请中的公开的目的在于提供一种不依赖于pam序列、pfs序列的核酸序列改变用组合物及改变核酸序列的靶部位的方法。
4、解决问题的手段
5、(1)一种包含rna和融合蛋白质的核酸序列改变用组合物，其中，
6、rna包括：
7、杂交区域，其能够与核酸序列的靶部位的5’侧或3’侧的序列杂交；以及
8、引导区域，其引导融合蛋白质，
9、引导区域包括与融合蛋白质形成复合体的识别区域，
10、融合蛋白质包括：
11、结合域，其识别所述rna的识别区域，并与识别区域形成复合体(其中，将结合域包含cas蛋白质组的rna识别区域除外)；以及
12、改变域，其改变核酸序列的靶部位。
13、(2)根据上述(1)所述的核酸序列改变用组合物，其中，
14、融合蛋白质包括连结结合域和改变域的连接序列。
15、(3)根据上述(1)或(2)所述的核酸序列改变用组合物，其中，
16、引导区域包括两个识别区域。
17、(4)根据上述(1)至(3)中任一项所述的核酸序列改变用组合物，包括：
18、第一互补区域，其与杂交区域的一端部连接，
19、通过第一互补区域与引导区域的一端部侧形成互补对，使杂交区域和引导区域间接地连接。
20、(5)根据上述(1)至(4)中任一项所述的核酸序列改变用组合物其中，
21、引导区域包括茎环。
22、(6)根据上述(1)至(5)中任一项所述的核酸序列改变用组合物，其中，
23、结合域包括nova的rna结合区域，
24、改变域包括对基因组dna进行切割的foki的开裂区域。
25、(7)根据上述(1)至(6)中任一项所述的核酸序列改变用组合物，其中，
26、核酸序列为基因组dna。
27、(8)一种核酸序列改变用组合物，包括：
28、成为用于转录上述(1)至(7)中任一项所述的rna的模板的核酸；以及
29、成为用于翻译上述(1)至(7)中任一项所述的融合蛋白质的模板的核酸。
30、(9)一种rna，其用于形成上述(1)至(7)中任一项所述的核酸序列改变用组合物。
31、(10)一种成为用于转录rna的模板的核酸，其用于形成上述(8)所述的核酸序列改变用组合物
32、(11)一种融合蛋白质，其用于形成上述(1)至(7)中任一项所述的核酸序列改变用组合物。
33、(12)一种成为用于翻译融合蛋白质的模板的核酸，其用于形成上述(8)所述的核酸序列改变用组合物。
34、(13)一种改变核酸序列的靶部位的方法，包括：
35、导入工序，将上述(1)至(8)中任一项所述的核酸序列改变用组合物导入细胞；以及
36、改变工序，改变域改变核酸序列的靶部位。
37、(14)根据上述(13)所述的改变核酸序列的靶部位的方法，在导入工序之前，包括：
38、杂交区域确定工序，确定能够与核酸序列的靶部位的5’侧或3’侧的序列杂交的杂交区域。
39、(15)根据上述(13)或(14)所述的改变核酸序列的靶部位的方法，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种包含RNA和融合蛋白质的核酸序列改变用组合物，其中，
2.根据权利要求1所述的核酸序列改变用组合物，其中，
3.根据权利要求1或2所述的核酸序列改变用组合物，其中，
4.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸序列改变用组合物，包括：
5.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸序列改变用组合物，其中，
6.根据权利要求1至5中任一项所述的核酸序列改变用组合物，其中，
7.根据权利要求1至6中任一项所述的核酸序列改变用组合物，其中，
8.一种核酸序列改变用组合物，包括：
9.一种RNA，其用于形成权利要求1至7中任一项所述的核酸序列改变用组合物。
10.一种成为用于转录RNA的模板的核酸，其用于形成权利要求8所述的核酸序列改变用组合物。
11.一种融合蛋白质，其用于形成权利要求1至7中任一项所述的核酸序列改变用组合物。
12.一种成为用于翻译融合蛋白质的模板的核酸，其用于形成权利要求8所述的核酸序列改变用组合物。
13.一种改变核酸序列的
14.根据权利要求13所述的改变核酸序列的靶部位的方法，在导入工序之前，包括：
15.根据权利要求13或14所述的改变核酸序列的靶部位的方法，其中，
16.根据权利要求15所述的改变核酸序列的靶部位的方法，其中，
17.根据权利要求16所述的改变核酸序列的靶部位的方法，在导入工序之前，包括：
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种包含rna和融合蛋白质的核酸序列改变用组合物，其中，
2.根据权利要求1所述的核酸序列改变用组合物，其中，
3.根据权利要求1或2所述的核酸序列改变用组合物，其中，
4.根据权利要求1至3中任一项所述的核酸序列改变用组合物，包括：
5.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸序列改变用组合物，其中，
6.根据权利要求1至5中任一项所述的核酸序列改变用组合物，其中，
7.根据权利要求1至6中任一项所述的核酸序列改变用组合物，其中，
8.一种核酸序列改变用组合物，包括：
9.一种rna，其用于形成权利要求1至7中任一项所述的核酸序列改变用组合物。
10.一种成为用...
【专利技术属性】
技术研发人员：中村郁郎，真壁壮，小桥雄一，森泉康裕，
申请(专利权)人：国立大学法人千叶大学，
类型：发明
国别省市：
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