新型抗糖链抗体及其用途制造技术

本发明专利技术提供一种抗体或其片段，其特异性地结合于6

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新型抗糖链抗体及其用途


[0001]本专利技术广泛涉及以糖链为靶标的新型抗体，特别是涉及抗体或其片段、及其用途等，所述抗体或其片段特异性地结合于6
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磺基唾液酸路易斯X(6
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sulfo sialyl Lewis X)糖链，该结合要求构成6
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磺基唾液酸路易斯X糖链的岩藻糖、硫酸基和唾液酸。

技术介绍

[0002]大多数免疫相关疾病的病情机理尚不明确，其中，自身免疫疾病是未满足的医疗需求(unmet medical needs)较高的疾病之一。在
[0003]自身免疫疾病中，关于多发性硬化症的治疗，针对作为掌管炎症细胞向中枢神经系统的浸润的粘附分子的VLA
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4整联蛋白的抗体那他珠单抗显示出病情改善效果，但有时会引起由JC病毒感染引起的进行性多灶性白质脑病。此外，作为低分子药物的Fingolimod(FTY720)虽然确认了作为多发性硬化症治疗药的有效性，但也已知传染病、缓脉性心律失常等副作用，期望开发作用机理不同的新型治疗药。FTY720将使受到抗原致敏的淋巴细胞停留在淋巴结内作为作用机理，但如果能够抑制淋巴细胞迁移到淋巴结内的过程(淋巴细胞归巢)，则认为有可能抑制淋巴结内的抗原致敏，得到包括多发性硬化症在内的各种免疫相关疾病的根本治疗。但是，迄今为止还不清楚是否能够通过抑制淋巴细胞向淋巴结的归巢来治疗自身免疫疾病等免疫相关疾病。
[0004]在免疫系统中，大量免疫细胞经由血液/淋巴液在生物体内循环，对外来抗原进行监视。其中，在外周血中循环的淋巴细胞向次级淋巴组织游走的现象被称为淋巴细胞归巢，通过多阶段的粘附分子级联而被严密地控制。因此，理解这些粘附分子级联，对于理解淋巴细胞的体内动态和组织指向性是重要的。
[0005]淋巴细胞归巢是为了高效地诱导免疫响应而具备的生物体防御机制，在淋巴细胞向外周淋巴结、肠系膜淋巴结、派尔集合淋巴结(Peyer's patch)等次级淋巴组织迁移时，在与由骰子状的特殊形态的内皮细胞构成的高内皮微静脉(high endothelial venule：HEV)粘附后向组织内浸润。
[0006]如果能够通过阻碍淋巴细胞归巢来抑制该淋巴细胞与HEV的特异性粘附，则认为例如能够控制生物体的过敏反应，有可能有助于各种疾病的治疗。但是，由于自身免疫疾病、过敏性疾病等免疫相关疾病的发病与各种因素相关，因此通过阻碍淋巴细胞归巢，是否能够治疗这些免疫相关疾病并不明确。
[0007]在粘合分子级联中，6
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磺基唾液酸路易斯X承担向介导淋巴细胞浸润的高内皮微静脉的初始粘附，因此是淋巴细胞归巢所必需的糖链结构。本专利技术人等制备了在糖链上转移硫酸基的硫酸基转移酶的基因缺失小鼠，证明了HEV中特异性表达的作为硫酸化糖链的6
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磺基唾液酸路易斯X对淋巴细胞向次级淋巴组织的归巢和接触性皮炎的发病起到必须的作用(非专利文献1：Kawa shima et al.，Nat.Immunol.，11：1096
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1104，2005)。
[0008]也已知有识别HEV的抗体，但由于在生物体内表达的糖链具有微量且多样的结合方式，因此通过抗体而识别的糖链结构不同。例如，对外周淋巴结的HEV进行特异性染色的
MECA
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79(非专利文献2：Streeter et al.，J.Cell Biol.，107：1853
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1862，1988)仅在存在于被称为伸长型核心1结构的特殊的O
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型糖链上的情况下识别6
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磺基唾液酸路易斯X。此外，该识别需要6
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磺基唾液酸路易斯X中的硫酸基，但在构成6
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磺基唾液酸路易斯X的糖链中，不需要对淋巴细胞归巢起重要作用的岩藻糖、唾液酸。此外，S1抗体及S2抗体(非专利文献3：Hirakawa et al.，J.Biol.Chem.，285：40864
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40878，2010)也识别6
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磺基唾液酸路易斯X，但该识别需要6
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磺基唾液酸路易斯X中的硫酸基及唾液酸，不需要岩藻糖。因此，这些抗体不仅与HEV结合，还与表达缺少岩藻糖的6
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磺基唾液酸LacNAc糖链的组织结合，无法否定对生物体带来淋巴细胞归巢的阻碍以外的意料之外的副作用的可能性。此外，作为抗唾液酸路易斯X单克隆抗体的F1抗体和F2抗体(非专利文献4：Matsumura et al.，J.Biol.Chem.，290：15313
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15326，2015)也识别6
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磺基唾液酸路易斯X，但该识别中不需要6
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磺基唾液酸路易斯X中的硫酸基，识别未被硫酸化的唾液酸路易斯X。因此，这些抗体除了与HEV结合而阻碍淋巴细胞归巢以外，还与表达唾液酸路易斯X的白细胞结合，也抑制P
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选择素、E
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选择素依赖性的白细胞的滚动。
[0009]S1抗体、S2抗体均为IgM级的抗体，因此难以以高纯度大量制备，因此难以验证其对需要频繁给药的自身免疫疾病等免疫相关疾病的治疗效果，其对自身免疫疾病等免疫相关疾病的治疗效果不明确。
[0010]此外，除了S1抗体、S2抗体以外，还已知有对6
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磺基唾液酸路易斯X具有结合性的抗体(非专利文献2、4、5、6)，但这些抗体对自身免疫疾病等免疫相关疾病的治疗效果也不明确。
[0011]现有技术文献
[0012]非专利文献
[0013]非专利文献1：Kawashima et al.,Nat.Immunol.,11：1096
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1104，2005
[0014]非专利文献2：Streeter et al.,J.Cell Biol.,107：1853
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1862，1988
[0015]非专利文献3：Hirakawa et al.,J.Biol.Chem.,285：40864
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40878，2010
[0016]非专利文献4：Matsumura et al.,J.Biol.Chem.,290：15313
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15326，2015
[0017]非专利文献5：Mitsuoka et al.,J.Biol.Chem.,273：11225
‑
11233，1998
[0018]非专利文献6：松浦宽明等,日本药学会第135年会要旨集(CD
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ROM),页：ROMBUNNO.27X
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PM05S,2015

技术实现思路

[0019]专利技术所解决的技术问题
[0020]本专利技术的目的在于，发现成为多发性硬化症等免疫相关疾病的有效的治疗靶标的糖链，并且提供与以该糖链为靶标的新型抗体，特别是提供特异性地结合于6
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种抗体或其片段，其特异性地结合于6
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磺基唾液酸路易斯X糖链，该结合要求构成6
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磺基唾液酸路易斯X糖链的岩藻糖、硫酸基和唾液酸，其中，所述抗体或其片段包含选自下述中的至少一个以上的CDR：(a)由SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列构成的CDRH1；(b)由SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列构成的CDRH2；(c)由SEQ ID NO.3所述的氨基酸序列构成的CDRH3；(d)由SEQ ID NO.4所述的氨基酸序列构成的CDRL1；(e)由SEQ ID NO.5所述的氨基酸序列构成的CDRL2；(f)由SEQ ID NO.6所述的氨基酸序列构成的CDRL3，或者，所述抗体或其片段包含至少一个以上的由在各CDR的氨基酸序列中具有1个或数个氨基酸的缺失、替换或添加的氨基酸序列构成的CDR，或者，所述抗体或其片段包含至少一个以上的由与各CDR的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列构成的CDR。2.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段含有包含下述CDR的重链可变区：(a)由SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列构成的CDRH1；(b)由SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列构成的CDRH2；和(c)由SEQ ID NO.3所述的氨基酸序列构成的CDRH3，或者，所述抗体或其片段含有包含由在各CDR的氨基酸序列中具有1个或数个氨基酸的缺失、替换或添加的氨基酸序列构成的CDRH1、CDRH2和CD RH3的重链可变区，或者，所述抗体或其片段含有包含由与各CDR的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列构成的CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区。3.根据权利要求2所述的抗体或其片段，其中，重链可变区包含SEQ ID NO.13、15～17中任一项所述的氨基酸序列的至少90个连续的氨基酸。4.根据权利要求2或3所述的抗体或其片段，其中，重链可变区包含：SEQ ID NO.13、15～17中任一项所述的氨基酸序列、在SEQ ID NO.13、15～17中任一项所述的氨基酸序列中具有1个或数个氨基酸的缺失、替换或添加的氨基酸序列、或与SEQ ID NO.13、15～17中任一项所述的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。5.根据权利要求2～4中任一项所述的抗体或其片段，其中，重链包含：SEQ ID NO.25、27或28所述的氨基酸序列、在SEQ ID NO.25、27或28所述的氨基酸序列中具有1个或数个氨基酸的缺失、替换或添加的氨基酸序列、或与SEQ ID NO.25、27或28所述的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。6.根据权利要求1～5中任一项所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段含有包含下述CDR的轻链可变区：(d)由SEQ ID NO.4所述的氨基酸序列构成的CDRL1；(e)由SEQ ID NO.5所述的氨基酸序列构成的CDRL2；和(f)由SEQ ID NO.6所述的氨基酸序列构成的CDRL3，或者，
所述抗体或其片段含有包含由在各CDR的氨基酸序列中具有1个或数个氨基酸的缺失、替换或添加的氨基酸序列构成的CDRL1、CDRL2和CDR L3的轻链可变区，或者，所述抗体或其片段含有包含由与各CDR的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列构成的CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区。7.根据权利要求6所述的抗体或其片段，其中，轻链可变区包含：SEQ ID NO.14、18～20中任一项所述的氨基酸序列的至少80个连续的氨基酸。8.根据权利要求6或7所述的抗体或其片段，其中，轻链可变区包含：SEQ ID NO.14、18～20中任一项所述的氨基酸序列、在SEQ ID NO.14、18～20中任一项所述的氨基酸序列中具有1个或数个氨基酸的缺失、替换或添加的氨基酸序列、或与SEQ ID NO.14、18～20中任一项所述的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。9.根据权利要求6～8中任一项所述的抗体或其片段，其中，轻链包含：SEQ ID NO.26所述的氨基酸序列、在SEQ ID NO.26所述的氨基酸序列中具有1个或数个氨基酸的缺失、替换或添加的氨基酸序列、或与SEQ ID NO.26所述的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。10.根据权利要求1～9中任一项所述的抗体或其片段，其中，所述抗体或其片段含有包含下述CDR的可变区：(a)由SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列构成的CDRH1；(b)由SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列构成的CDRH2；(c)由SEQ ID NO.3所述的氨基酸序列构成的CDRH3；(d)由SEQ ID NO.4所述的氨基酸序列构成的CDRL1；(e)由SEQ ID NO.5所述的氨基酸序列构成的CDRL2；和(f)由SEQ ID NO.6所述的氨基酸序列构成的CDRL3，或者，所述抗体或其片段含有包含由在各CDR的氨基酸序列中具有1个或数个氨基酸的缺失、替换或添加的氨基酸序列构成的CDRH1、CDRH2和CD RH3以及CDRL1、CDRL2和CDRL3的可变区，或者，所述抗体或其片段含有包含由与各CDR的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列构成的CDRH1、CDRH2和CDRH3以及CDRL1、CD RL2和CDRL3的可变区。11.根据权利要求1～10中任一项所述的抗体或其片段，其阻碍表达6
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磺基唾液酸路易斯X糖链的高内皮微静脉与L
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选择素的结合。12.根据权利要求1～11中任一项所述的抗体或其片段，其恒定区源自人。13.根据权利要求1～12中任一项所述的抗体或其片段，其进行了人源化。14.根据权利要求1～13中任一项所述的抗体或其片段，其选自Fab、F(ab
’
)2、Fab
’
、Fv和单链抗体。15.根据权利要求14所述的抗体或其片段，其中，单链抗体包含：SEQ ID NO.21～24中任一项所述的氨基酸序列中的第1～117个和第133～238个的氨基酸序列、在SEQ ID NO.21～24中任一项所述的氨基酸序列中的第1～117个和第133～238个的氨基酸序列中具有1个或数个氨基酸的缺失、替换或添加的氨基酸序
列、或与SEQ ID NO.21～24中任一项所述的氨基酸序列中的第1～117个和第133～238个的氨基酸序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。16.根据权利要求1～15中任一项所述的抗体或其片段，其中，抗体或其片段对于6
‑
磺基唾液酸路易斯X糖链表现出1
×
10
‑6M以下的解离常数(K
D
值)。17.一种多核苷酸，其编码权利要求1～16中任一项所述的抗体或其片段。18.一种表达载体，其包含：权利要求17所述的多核苷酸。19.一种宿主细胞，其通过权利要求18所述的表达载体进行了转染。20.根据权利要求19所述的宿主细胞，其为真核细胞。21.一种杂交瘤，其产生权利要求1～16中任一项所述的抗体。22.一种淋巴细胞归巢抑制剂，其包含：权利要求1～16中任一项所述的抗体或其片段、权利要求17所述的多核苷酸、或权利要求18所述的表达载体。23.一种药物组合物，其包含：权利要求1～16中任一项所述的抗体或其片段、权利要求17所述的多核苷酸、或权利要求18所述的表达载体。24.根据权利要求23所述的药物组合物，其用于治疗或预防因淋巴细胞归巢而引起的免疫响应过度作用而产生的疾病。25.根据权利要求24所述的药物组合物，其中，因淋巴细胞归巢而引起的免疫响应过度作用而产生的疾病为免疫相关疾病。26.根据权利要求25所述的药物组合物，其中，免疫相关疾病为过敏性疾病或自身免疫疾病。27.根据权利要求26所述的药物组合物，其中，免疫相关疾病为选自过敏性鼻炎、特应性皮炎、食物过敏、口腔过敏综合征、药剂过敏、花粉症、过敏性结膜炎、嗜酸性粒细胞性肺炎、过敏性胃肠炎、荨麻疹、光线过敏症、金属过敏、猫过敏、螨虫过敏和哮喘中的过敏性疾病。28.根据权利要求26所述的药物组合物，其中，免疫相关疾病为选自复发缓解型多发性硬化症、一次进展型多发性硬化症和二次进展型多发性硬化症的多发性硬化症；银屑病；类风湿关节炎；银屑病性关节炎；系统性红斑狼疮(SLE)；溃疡性大肠炎；克罗恩病；良性淋巴细胞性血管炎；血小板减少性紫癜；突发性血小板减少症；特发性自身免疫性溶血性贫血；红细胞再生障碍；舍格伦综合征；风湿性疾病；结缔组织疾病；炎症性风湿病；变形性风湿病；非关节性风湿病；青少年类风湿关节炎；肌肉风湿病；慢性多发性关节炎；冷球蛋白血管炎；ANCA相关血管炎；抗磷脂综合征；重症肌无力；自身免疫性溶血性贫血；吉兰
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巴雷综合征；慢性免疫性多发神经病；自身免疫性甲状腺炎；胰岛素依赖性糖尿病；1型糖尿病；艾迪森病；膜性肾小球肾病；抗肾小球基底膜肾病；自身免疫性胃炎；自身免疫性萎缩性胃炎；恶性贫血；天疱疮；寻常性天疱疮；肝硬化；原发性胆汁性肝硬化；皮肌炎；多发性肌炎；纤维肌炎；肌硬症；乳糜泻；免疫球蛋白A肾病；Henoch
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Schonlein紫癜；埃文斯综合征；银屑病；关节症性银屑病；格雷夫斯病；格雷夫斯眼病；硬皮症；系统性硬皮症；进行性系统性硬皮症；原发性胆汁性肝硬化；桥本甲状腺炎；原发性粘液
水肿；交感性眼炎；自身免疫性葡萄膜炎；肝炎；慢性活动性肝炎；胶原病；强直性脊椎炎；肩关节周围炎；结节性多动脉炎；软骨钙化症；韦格纳氏肉芽肿症；显微镜下多血管炎；慢性荨麻疹；水疱性皮肤病；类天疱疮；德维克病；小儿自身免疫性溶血性贫血；难治性或慢性自身免疫性血细胞减少症；后天性血友病A；冷凝集素病；视神经脊髓炎；全身僵硬综合征；胰腺炎；心肌炎；血管炎；胃炎；痛风；痛风性关节炎；银屑病；正补体血症性荨麻疹样血管炎；心膜炎；肌炎；抗合成酶综合征；巩膜炎；巨噬细胞活化综合征；贝赫切特综合征；PAPA综合征；Blau综合征；成人和青少年斯蒂尔病；Cryopy rin相关周期性综合征；Muckle
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Wells综合征；家族性冷因性自身炎症性综合征；新生儿期发病多脏器性炎症性疾病；家族性地中海热；慢性婴儿期发病神经皮肤关节综合征；全身型青少年特发性关节炎；高IgD综合征；施尼茨勒综合征；自身免疫性视网膜症；动脉粥样硬化；慢性前立腺炎；和TNF受体相关周期性综合征(TRAPS)中的自身免疫疾病。29.根据权利要求28所述的药物组合物，其中，自身免疫疾病为多发性硬化症或胶原病。30.根据权利要求28或29所述的药物组合物，其中，胶原病为选自类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、硬皮症、皮肌炎、结节性多发动脉炎、混合性结缔组织病、舍格伦综合征、显微镜下多血管炎、嗜酸性肉芽肿性多血管炎、过敏性血管炎、贝赫切特病、科干综合征、RS3PE、巨细胞性动脉炎、成人斯蒂尔病、风湿性多发肌痛症、纤维肌痛症和SAPH O综合征中的一种或多种疾病。31.根据权利要求24～30中任一项所述的药物组合物，其进一步包含：用于治疗或预防因淋巴细胞归巢而引起的免疫响应过度作用而产生的疾病的药剂。32.一种方法，其为制造权利要求1～16中任一项所述的抗体或其片段的方法，其中，所述方法包含：培养权利要求19或20所述的宿主细胞或权利要求21所述的杂交瘤的工序。33.一种用于治疗或预防因淋巴细胞归巢而引起的免疫响应过度作用而产生的疾病的药物组合物，其包含：抗体或其片段、编码该抗体或其片段的多核苷酸、或包含该多核苷酸的表达载体，所述抗体或其片段特异性地结合于6
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磺基唾液酸路易斯X糖链，该结合要求构成6
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磺基唾液酸路易斯X糖链的岩藻糖、硫酸基和唾液酸。34.根据权利要求33所述的药物组合物，其中，因淋巴细胞归巢而引起的免疫响应过度作用而产生的疾病为免疫相关疾病。35.根据权利要求34所述的药物组合物，其中，免疫相关疾病为过敏性疾病或自身免疫疾病。36.根据权利要求35所述的药物组合物，其中，免疫相关疾病为选自过敏性鼻炎、特应性皮炎、食物过敏、口腔过敏综合征、药剂过敏、花粉症、过敏性结膜炎、嗜酸性粒细胞性肺炎、过敏性胃肠炎、荨麻疹、光线过敏症、金属过敏、猫过敏、螨虫过敏和哮喘中的过敏性疾病。37.根据权利要求35所述的药物组合物，其中，免疫相关疾病为选自复发缓解型多发性硬化症、一次进展型多发性硬化症和二次进展型多发性硬化症的多发性硬化症；银屑病；类风湿关节炎；银屑病性关节炎；系统性红斑狼
疮(SLE)；溃疡性大肠炎；克罗恩病；良性淋巴细胞性血管炎；血小板减少性紫癜；突发性血小板减少症；特发性自身免疫性溶血性贫血；红细胞再生障碍；舍格伦综合征；风湿性疾病；结缔组织疾病；炎症性风湿病；变形性风湿病；非关节性风湿病；青少年类风湿关节炎；肌肉风湿病；慢性多发性关节炎；冷球蛋白血管炎；ANCA相关血管炎；抗磷脂综合征；重症肌无力；自身免疫性溶血性贫血；吉兰
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巴雷综合征；慢性免疫性多发神经病；自身免疫性甲状腺炎；胰岛素依赖性糖尿病；1型糖尿病；艾迪森病；膜性肾小球肾病；抗肾小球基底膜肾病；自身免疫性胃炎；自身免疫性萎缩性胃炎；恶性贫血；天疱疮；寻常性天疱疮；肝硬化；原发性胆汁性肝硬化；皮肌炎；多发性肌炎；纤维肌炎；肌硬症；乳糜泻；免疫球蛋白A肾病；Henoch
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Schonlein紫癜；埃文斯综合征；...

【专利技术属性】
技术研发人员：川岛博人，松村龙志，
申请(专利权)人：国立大学法人千叶大学，
类型：发明
国别省市：