一种可诱导植物细胞坏死的小麦黄花叶病毒14K蛋白及其在抗病毒中的用途制造技术

本发明专利技术属于农业科学技术领域，涉及农作物病毒病害的分子检测技术，具体涉及一种可诱导植物细胞坏死的小麦黄花叶病毒14K蛋白及其在抗病毒中的用途，所述14K蛋白可显著抑制TRV病毒在本氏烟上系统侵染。同时，经蛋白预测发现14K具有一个跨膜结构域，缺失该结构后丧失诱导植物细胞坏死的能力。该蛋白可为农作物抗性品种的选育提供有效的候选靶标，从而增强作物在田间的抗病毒能力。在田间的抗病毒能力。

【技术实现步骤摘要】
一种可诱导植物细胞坏死的小麦黄花叶病毒14K蛋白及其在抗病毒中的用途


[0001]本专利技术属于农业科学
，涉及农作物病毒病害的分子检测技术，具体涉及一种可诱导植物细胞坏死的小麦黄花叶病毒14K蛋白及其在抗病毒中的用途。

技术介绍

[0002]土传小麦病毒由土壤中的禾谷多黏菌(Polymyxa graminis L.)传播，禾谷多黏菌是一种专性寄生于禾本科植物根部的原生生物。由禾谷多黏菌传播的禾谷类病毒小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)属于大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)。WYMV广泛分布于安徽、河南、江苏、湖北、陕西、四川和山东等冬小麦生态区。上世纪60年代以前，小麦黄花叶病害仅在我国少数地区发生。自70年代至今，已成为河南、江苏、山东等省的重要麦类病害，蔓延迅速发病面积逐年增多，致使小麦病田严重减产。由于其传播介体禾谷多黏菌可在土壤中长期存活，且抗逆性极强，防治困难，因此目前防治土传小麦病毒病的最重要的方式是鉴定和推广抗性品种。
[0003]WYMV为弯曲线状病毒粒子，由RNA1和RNA2两条正义单链的RNA组成。RNA1全长共7636个核苷酸，只编码一个由2404个氨基酸组成的多聚蛋白的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，经蛋白酶切割后形成8个成熟的蛋白，分别为P3，7K，细胞质内含体蛋白(cytoplasmic inclusion，CI)，14K，基因组连接蛋白(viral genome
‑
linked protein，VPg)，细胞核内含体蛋白a(nuclear inclusion a,NIa)，细胞核内含体蛋白b(nuclear inclusion b，NIb)和外壳蛋白(coat protein,CP)。WYMV RNA2全长共3651个核苷酸，整个基因组也仅有一个ORF，编码一个904个氨基酸组成的约100kDa的多聚蛋白，通过切割产生P1和P2两个成熟的非结构蛋白。14K是WYMV中分子量较小的蛋白，富含疏水性氨基酸，具有一个跨膜结构域(transmembrane domains,TMD)，目前对WYMV 14K蛋白功能解析还是未知的。
[0004]病毒属于专性寄生物，必须在宿主细胞内才能完成病毒的生活史，其中包括病毒的增殖和移动。病毒在侵染植物细胞过程中植物通过识别病毒致病因子激活植物免疫反应以抵抗病毒侵染，这其中包括细胞坏死反应。细胞坏死的特点是在病毒侵染的细胞周围诱导程序性细胞死亡以限制病毒扩散，该坏死症状通常从病毒侵染的叶片开始坏死，逐渐扩散到植物茎杆基部及周边叶片的坏死。因此，研究诱导植物细胞坏死的病毒蛋白可为农作物抗性品种的选育提供有效的候选靶标。

技术实现思路

[0005]本专利技术鉴定了小麦黄花叶病毒14K蛋白的功能。利用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导的基因过表达体系，明确了小麦黄花叶病毒基因组中14K蛋白诱导植物细胞坏死并抑制TRV病毒系统侵染。本专利技术公开了一种氨基酸序列：LVYVICLLILINLIYRLL(SEQ.NO.15,14K蛋白跨膜结构域)。
[0006]进一步的，本专利技术公开了一种含有上述SEQ.NO.15的氨基酸序列：SNDMLTDETLSNALGIFNPKTNLFLLLATKGFKLVYVICLLILINLIYRLLSHWRAWLKNKNDNVNPDALTNTMTVQEGSEILKEVLKMTPAMRREVTKDMKVAVADNDSTFSFVFPHEHIDLE(SEQ.NO.16,14K蛋白)。
[0007]同时，本专利技术公开了一种编码所述14K蛋白的核苷酸序列:TCAAACGACATGTTGACTGATGAAACACTGTCAAACGCTCTAGGCATCTTCAACCCAAAGACCAACCTCTTCCTCCTTCTCGCAACCAAAGGTTTTAAACTTGTTTACGTTATCTGCCTGCTTATATTAATAAACCTCATCTACCGCTTGCTCTCCCACTGGAGAGCTTGGTTGAAGAACAAGAACGATAACGTGAATCCCGATGCCCTCACCAACACCATGACAGTTCAGGAAGGAAGCGAAATTCTCAAGGAAGTATTGAAGATGACTCCAGCGATGCGCAGGGAGGTGACCAAGGATATGAAAGTTGCAGTTGCTGATAACGACAGCACATTCTCTTTCGTGTTCCCTCACGAACACATTGACCTCGAG(SEQ.NO.17,14K蛋白核苷酸序列)。
[0008]另一方面，本专利技术公开一种用于扩增所述基因(SEQ.NO.17)的一对引物：TCAAACGACATGTTGACT(SEQ.NO.18)和TCACTCGAGGTCAATGTGT(SEQ.NO.19)。
[0009]另外，本专利技术提供了一种TRV
‑
14K重组载体。
[0010]再一方面，本专利技术提供了所述14K蛋白跨膜结构域和14K蛋白在制备抗病毒剂中的用途。
[0011]本专利技术的具体研究过程如下：
[0012]1.将NCBI中WYMV RNA1(GenBank:NC_002350.1)和RNA2(GenBank：NC_002349.1)分别划分18和9个核酸片段(编为1
‑
1至1
‑
18，2
‑
1至2
‑
9，每个片段约500
‑
600bp，连续的两个片段之间含有重叠片段)，并将这些核苷酸序列正义链连接到TRV载体(TRV
‑
RNA2)中，并与TRV
‑
RNA1农杆菌共浸润本氏烟，设置报告基因GUS片段构建于TRV载体中，以过表达TRV
‑
GUS作为阴性对照，持续观察本氏烟症状表型。实验结果表明农杆菌浸润5天后，与对照组相比，过表达1
‑
9片段(TRV
‑1‑
9)引起本氏烟接种叶片及茎基部的明显细胞坏死反应，并且显著抑制TRV病毒系统性侵染(图1)。
[0013]2.为明确诱导坏死反应的因子是1
‑
9产生的多肽或病毒来源的小干扰RNA(vsiRNA)，本研究将1
‑
9的反向互补序列构建到TRV载体，发现其并未引起明显坏死症状，表明引起本氏烟坏死症状的不是vsiRNA。另外我们将1
‑
9序列中对应WYMV的7个翻译起始密码子及其5
’
端的延伸序列进行缺失突变，分别构建到TRV过表达载体中(TRV
‑1‑
9M1至TRV
‑1‑
9M7)(图2)，并通过农杆菌共浸润法侵染本氏烟并持续观察症状。
[0014][0015][0016]结果表明，侵染5天后除了TRV
‑1‑
9M1可以诱导细胞坏死外，其余突变体和对照相比均无明显变本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种氨基酸序列：LVYVICLLILINLIYRLL(SEQ.NO.15)。2.一种氨基酸序列：SNDMLTDETLSNALGIFNPKTNLFLLLATKGFKLVYVICLLILINLIYRLLSHWRAWLKNKNDNVNPDALTNTMTVQEGSEILKEVLKMTPAMRREVTKDMKVAVADNDSTFSFVFPHEHIDLE(SEQ.NO.16)。3.一种编码权利要求2所述氨基酸序列的核苷酸序列:TCAAACGACATGTTGACTGATGAAACACTGTCAAACGCTCTAGGCATCTTCAACCCAAAGACCAACCTCTTCCTCCTTCTCGCAACCAAAGGTTTTAAACTTGTTTACGTTATCTGCCTGCTTATATTAATAAACCTCATCTACCGCTTGCTCTCCCACTGGAGAGCTTGGTTGAAGAACAAGAACGATAACGTGAATCCCGATGCCCTCACCAACACCATGACAGTTCAGGAAGGAAGCGAAATTCTCAAGGAAGTATTGAAGATGACTCCAGCGATGCGCAGGGAGGTGACCAAGGATATGAAAGTTGCAGTTGCTGATAACGACAGCACATTCTCTTTCGTGTTCCCTCACGAACACATTGACCTC...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢刚，张岩，鲁燕华，李俊敏，陈剑平，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：