本发明专利技术涉及一种基于不对称扩增的文库构建引物组及其应用，属于基因检测技术领域。该文库构建引物组包括：接头序列、由若干种基因特异性引物组成的引物池、通用扩增引物，所述接头序列依次由配对茎结构序列、单分子标签序列、第一样本标签序列和芯片固定序列组成，所述基因特异性引物由特异性互补引物、测序引物和第二样本标签序列组成。本发明专利技术的文库构建引物组及采用该文库进行的基因检测，既具有基于多重PCR的二代测序捕获率高，覆盖率高的优点，又能利用UMI进行数据校正，特别适用于微小残留病等靶标含量低、精度要求高的检测中。精度要求高的检测中。
【技术实现步骤摘要】
基于不对称扩增的文库构建引物组及其应用
[0001]本专利技术涉及基因检测
，特别是涉及一种基于不对称扩增的文库构建引物组及其应用。
技术介绍
[0002]二代测序在精准医学中发挥极为重要的应用，其中，文库制备是二代测序流程的关键步骤，目前主流的文库制备方法有两种，一种是基于多重PCR的二代测序建库技术；另一种是基于靶向探针捕获方法。
[0003]基于靶向探针捕获方法的简要流程是将DNA打断成200
‑
300碱基小片段；进行DNA片段末端补平，并增加一个核苷酸黏性末端；然后连接样本标签接头到DNA片段；将构建好的文库进行探针杂交捕获。
[0004]基于多重PCR的二代测序建库简要流程为1)针对靶标区域或设计双端特异性引物，上游引物在下游引物的3
’
下游100
‑
150bp的位置，混合为定制引物Panel；2)使用引物panel扩增获取目标区域；然后进行DNA片段末端补平，并增加一个核苷酸黏性末端；然后连接样本标签接头到DNA片段。
[0005]然而，基于靶向探针捕获方法仅适合于大panel靶向捕获测序，对于单基因或寡基因的小panel，其捕获效率低，覆盖率差，难以适应微小残留病监测(MRD)等应用。
[0006]而基于多重PCR的建库方法无法和单分子标签(Unique Molecular Identifier，UMI)联合，无法对残留噪音进行矫正或纠错。
技术实现思路
[0007]基于此，有必要针对上述问题，提供一种基于不对称扩增的文库构建引物组，具有较高捕获效率和覆盖率，可适用于微小残留病的监测等。
[0008]一种基于不对称扩增的文库构建引物组，包括：接头序列、由若干种基因特异性引物组成的引物池、通用扩增引物，所述接头序列依次由配对茎结构序列、单分子标签序列、第一样本标签序列和芯片固定序列组成，所述基因特异性引物由特异性互补引物、测序引物和第二样本标签序列组成。
[0009]上述基于不对称扩增的文库构建引物组，为不对称PCR扩增系统，以针对特定靶标区域的基因特异性引物组成的引物池和常规通用扩增引物联合扩增靶标区域，其中基因特异性引物携带有第二样本标签index2。同时，还在DNA片段两端引入带有单分子标签(Unique Molecular Identifier，UMI)的接头序列，从而在文库构建中，能够基于多重PCR的建库方法，获得带有单分子标签的文库，进而在后续生物信息学分析中对残留噪音进行矫正或纠错，由此消除PCR错误与测序错误。
[0010]在其中一个实施例中，所述配对茎结构序列为12
±
4bp互补配对的碱基对，所述单分子标签为12
±
4nt的随机碱基，所述第一样本标签序列为8
±
2nt的index1，所述第二样本标签序列为8
±
2nt的index2。
[0011]在其中一个实施例中，所述芯片固定序列为20nt的P5序列。
[0012]在其中一个实施例中，所述基因特异性引物A的浓度为0.04
‑
0.00004μM，所述通用扩增引物B的浓度为0.05
‑
1μM，且所述基因特异性引物的浓度总和与所述通用扩增引物的摩尔浓度比k>38，同时k>n
‑
4，n为基因特异性引物A的种类数。本专利技术通过实验证实，按照上述条件进行不对称扩增，能够获得较理想的扩增效果。
[0013]在其中一个实施例中，所述浓度比k通过以下方法得到：
[0014]建立数学模型a+b＝2(aa+ab)+a
’
+b
’
，其中，a为基因特异性引物A的浓度，b为通用扩增引物B的浓度b，a
’
为体系中剩余基因特异性引物A的浓度，b
’
为体系中剩余通用扩增引物B的浓度；则a
’
＝a
‑
(2aa+ab)，b
’
＝b
‑
ab；
[0015]由于产生AA的概率aa，产生AB的概率为ab；在ab最大同时aa较小的情况下，以概率模型求得最优的a与b，k＝b/a；
[0016]其中根据目的区域设计的特异性引物A包括n种特异性引物，a为各特异性引物A的浓度。可以理解的，按照上述数学模型，本领域技术人员可根据具体引物投入情况及扩增要求，利用常规概率模型求解得到最优值。
[0017]在其中一个实施例中，所述特异性互补引物长度为22
‑
26nt，GC含量为45
‑
55％，Tm为60
‑
70℃，且Tm
‑
L
–
Tm
‑
X≥0；其中，Tm
‑
L为特异性互补引物的熔解温度，Tm
‑
X为通用扩增引物的熔解温度。在不对称PCR中，限制性引物(即通用扩增引物)的浓度较低，会降低其在最优退火反应中的熔解温度，导致扩增效率减弱。为此，我们在引物设计过程中引入了(TmL
–
TmX)≥0指标，保证整个不对称PCR过程的整体扩增效率。
[0018]在其中一个实施例中，所述配合引物序列如SEQ ID NO.1所示，所述基因特异性引物序列选自SEQ ID NO.2
‑
412所示序列。
[0019]本专利技术还公开了一种基于不对称扩增的文库构建方法，包括以下步骤：
[0020]引物设计：获取目标扩增基因参考序列作为引物设计模板，将模板序列分割为DNA片段，设计每段DNA片段的上下游引物，使所得扩增产物片段比所述DNA片段短20
‑
50bp；
[0021]构建引物池：合成上述设计得到的引物，并在其一端添加测序引物和第二标本标签序列；
[0022]制备接头序列：制备上述的接头序列，备用；
[0023]文库构建：取待测样本，提取核酸并加上所述接头序列，纯化去除多余接头，加入上述述的基因特异性引物和通用扩增引物，进行PCR扩增富集靶标区域，纯化产物，采用通用引物与携带测序引物和第二样本标签序列配对的引物扩增靶标文库，即得所述基于不对称扩增的文库。
[0024]在其中一个实施例中，所述引物设计步骤中，将所述引物设计模板分割为245bp长的DNA片段，并使相邻的DNA片段之间有约100bp的重叠区域；设计得到的特异性互补引物长度为22
‑
26nt，GC含量为45
‑
55％，Tm为60
‑
70℃，且Tm
‑
L
–
Tm
‑
X≥0；其中，Tm
‑
L为特异性互补引物的熔解温度，Tm
‑
X为通用扩增引物的熔解温度。
[0025]在其中一个实施例中，所述引物设计步骤中，根据引物之间的距离调整引本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基于不对称扩增的文库构建引物组，其特征在于，包括：接头序列、由若干种基因特异性引物组成的引物池、通用扩增引物，所述接头序列依次由配对茎结构序列、单分子标签序列、第一样本标签序列和芯片固定序列组成，所述基因特异性引物由特异性互补引物、测序引物和第二样本标签序列组成。2.根据权利要求1所述的基于不对称扩增的文库构建引物组，其特征在于，所述配对茎结构序列为12
±
4bp互补配对的碱基对，所述单分子标签为12
±
4nt的随机碱基，所述第一样本标签序列为8
±
2nt的index1，所述第二样本标签序列为8
±
2nt的index2。3.根据权利要求1所述的基于不对称扩增的文库构建引物组，其特征在于，所述芯片固定序列为20nt的P5序列。4.根据权利要求1所述的基于不对称扩增的文库构建引物组，其特征在于，所述基因特异性引物A的浓度为0.04
‑
0.00004μM，所述通用扩增引物B的浓度为0.05
‑
1μM，且所述基因特异性引物的浓度总和与所述通用扩增引物的摩尔浓度比k>38，同时k>n
‑
4，n为基因特异性引物A的种类数。5.根据权利要求1
‑
3任一项所述的基于不对称扩增的文库构建引物组，其特征在于，所述浓度比k通过以下方法得到：建立数学模型a+b＝2(aa+ab)+a
’
+b
’
，其中，a为基因特异性引物A的浓度，b为通用扩增引物B的浓度b，a
’
为体系中剩余基因特异性引物A的浓度，b
’
为体系中剩余通用扩增引物B的浓度；则a
’
＝a
‑
(2aa+ab)，b
’
＝b
‑
ab；由于产生AA的概率aa，产生AB的概率为ab；在ab最大同时aa较小的情况下，以概率模型求得最优的a与b，k＝b/a；其中根据目的区域设计的特异性引物A包括n种特异性引物，a为各特异性引物A的浓度。6.根据权利要求1
‑
3任一项所述的基于不对称扩增的文库构建引物组，其特征在于，所述特异性互补引物长度为22
‑
26nt，GC含量为45
‑
55％，Tm为60
‑
70℃，且Tm
‑
L
–
Tm
【专利技术属性】
技术研发人员：黄晓强，沈建如，陈遥，凌宝，贺亮，程雅婷，于世辉，马骥，
申请(专利权)人：广州市金域转化医学研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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