一种紫红曲霉YJX-8cDNA文库的构建方法及应用技术

本发明专利技术属于微生物技术领域，具体涉及一种紫红曲霉YJX

【技术实现步骤摘要】
一种紫红曲霉YJX
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8 cDNA文库的构建方法及应用


[0001]本专利技术属于微生物
，尤其涉及一种紫红曲霉YJX
‑
8 cDNA文库的构建方法及利用该文库进行酯合成酶LIP05互作蛋白的筛选应用。

技术介绍

[0002]白酒的主体物质为水和乙醇，含有的少量酯、酸、酮类化合物等风味物质，决定产品香型。其中，己酸乙酯和辛酸乙酯是浓香型白酒品质的重要表征物质，而酒体中己酸乙酯等酯类物质含量作为产品品质的重要衡量标准已在业内达成广泛共识。白酒酿造过程中产酯生香周期长，酯合成量低且不稳定，导致优质浓香型白酒出酒率低，严重影响酒质和产量。究其原因是发酵过程中酿酒微生物中酯合成酶催化己酸乙酯合成效率不稳定。探究己酸乙酯等重要酯类物质的合成机制，对从根本上保障浓香型白酒品质和产量的稳定性，提供实际应用价值。中国传统浓香型白酒酿造过程独特而复杂，不同种属的多种功能微生物均可以产生酯合成酶进而生成己酸乙酯等酯类风味物质。研究表明，浓香型白酒中紫红曲霉YJX
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8来源酯合成酶LIP05对己酸乙酯的高效合成具有显著贡献。然而到目前为止，紫红曲霉来源高效催化己酸乙酯和辛酸乙酯合成的酯合成酶调控机制尚未见报道。揭示调控酯合成酶LIP05催化己酸乙酯合成的分子机理，有利于根源性解决该科学问题。构建紫红曲霉YJX
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8 cDNA文库，以LIP05为诱饵，利用酵母双杂交系统筛选其互作蛋白以全面系统深度解析LIP05合成己酸乙酯过程中所受的调控机制。该文库的构建方法和应用，为高品质白酒商业化大规模生产提供重要理论参考。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供一种紫红曲霉YJX
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8 cDNA文库的构建方法及利用该文库进行酯合成酶LIP05互作蛋白的筛选应用。
[0004]本专利技术是通过以下技术方案来实现：
[0005]本专利技术公开了一种紫红曲霉YJX
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8 cDNA文库的构建方法。
[0006]本专利技术还公开了利用紫红曲霉YJX
‑
8 cDNA文库进行酯合成酶LIP05互作蛋白的筛选应用。
[0007]本专利技术还公开了利用紫红曲霉YJX
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8 cDNA文库筛选到酯合成酶LIP05的互作蛋白为细胞核酸结合蛋白和真核翻译起始因子。
[0008]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果：
[0009]本专利技术利用分子生物学技术，提取紫红曲霉YJX
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8总RNA，逆转录成cDNA，利用试剂盒进行cDNA文库的构建。
[0010]本专利技术提供的紫红曲霉YJX
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8 cDNA文库的构建方法及利用该文库进行酯合成酶LIP05互作蛋白的筛选应用，为全面系统深度探究LIP05合成己酸乙酯过程中所受的调控机制和白酒酿造工艺持续发展提供参考。
附图说明
[0011]图1为紫红曲霉YJX
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8 cDNA文库稀释液SD/
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Leu平板涂布，(a)稀释10000倍涂布于SD/
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Leu培养基；(b)稀释100倍涂布于SD/
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Leu培养基
[0012]图2为pGBKT7
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LIP05的毒性检测
[0013]图3为pGBKT7
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LIP05的转录自激活活性检测
[0014]图4为SD/
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Leu/
‑
Trp/X
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α
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Gal/AbA培养基上阳性克隆筛选，(a)初次筛选；(b)二次筛选；(c)三次筛选
[0015]图5为酵母双杂交实验验证LIP05互作蛋白
具体实施方式
[0016]下面结合具体的附图和实施例对本专利技术做进一步的详细说明，所述是对本专利技术的解释而不是限定。下述实施例中未详细述及的操作步骤或条件，均按照本领域常规技术、条件实现。
[0017]实施例1紫红曲霉YJX
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8 cDNA文库的构建
[0018]1.紫红曲霉YJX
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8培养
[0019]将紫红曲霉YJX
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8接种于PDA斜面培养基，在30℃条件下静置培养72h，使菌丝体布满培养基。利用无菌水洗涤孢子，孢子悬浮液置于30℃条件下，180rpm培养5d。
[0020]2.紫红曲霉YJX
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8总RNA提取
[0021]DEPC水冲洗菌丝，滤纸吸干，迅速置于预冷的研钵中，加入液氮充分研磨成粉末，利用试剂盒提取样品的总RNA，1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。
[0022]3.紫红曲霉YJX
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8 cDNA第一链合成
[0023]以紫红曲霉YJX
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8总RNA为模板，依据Gold酵母双杂系统(Clontech公司)说明书合成cDNA第一条链。
[0024]离心管中加入RNA 2μL，Oligo
‑
dT Primer 2μL，ddH2O 1μL，反应条件为72℃，2min；冰浴2min，14000
×
g离心10s。离心管中加入产物4μL，5
×
First
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Strand Buffer 2μL，DTT(100mM)1μL，dNTP Mix(10mM)1μL，SMART MMLV ReverseTranscriptase 1μL，反应条件为25℃，10min；42℃，10min。加入1μL SMART III
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modifed oligo，混匀，反应条件：42℃，1h；75℃，10min。加入1μL RNase H，反应条件为37℃，10min，获得cDNA第一链。
[0025]4.ds cDNA合成
[0026]利用LD
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PCR方法扩增上述cDNA第一链，合成ds cDNA，反应体系如表1所示。
[0027]表1 ds cDNA合成反应体系
[0028][0029][0030]PCR反应程序如表2所示。
[0031]表2 PCR反应程序
[0032][0033]1.2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。采用CHROMASPIN+TE
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400纯化柱纯化ds cDNA。
[0034]5.紫红曲霉YJX
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8 cDNA文库质量检测
[0035]统计SD/
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Leu培养基平板中菌斑数量(图1)，计算文库库容量和滴定度。
[0036]实施例2紫红曲霉YJX
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8酯合成酶LIP05互作蛋白的筛选
[0037]1.pGBKT7
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LIP05诱饵载体的构建
[0038]以去除信号肽后的LIP05序列为模板进行引物设计，引物序列如下本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种紫红曲霉YJX
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8 cDNA文库的构建方法，其特征在于，所述紫红曲霉YJX
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8经培养后进行总RNA的提取和cDNA的第一链合成，扩增上述第一链cDNA，合成ds cDNA，完成紫红曲霉YJX
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8 cDNA文库的构建。2.由权利要求1所述构建方法创制而成紫红曲霉YJX
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8 cDNA文库的应用，其特征在于，可借助酵母双杂交技术应用于紫...

【专利技术属性】
技术研发人员：李秀婷，杜秉昊，李微微，庞泽敏，
申请(专利权)人：北京工商大学，
类型：发明
国别省市：