病毒核酸样品处理液、试剂、提取方法及其应用技术

本发明专利技术涉及核酸提取领域，尤其涉及病毒核酸样品处理液、试剂、提取方法及其应用。本发明专利技术提供了样品处理液，其中组分1包括液化缓冲液：0.5~1.5 mg/mL蛋白酶K；组分2包括样品保存液：Tris

【技术实现步骤摘要】
病毒核酸样品处理液、试剂、提取方法及其应用


[0001]本专利技术涉及核酸提取领域，尤其涉及病毒核酸样品处理液、试剂、提取方法及其应用。

技术介绍

[0002]痰是人体呼吸道的分泌物，它是通过支气管纤毛运动上皮纤毛的运动，从肺部向上呼吸道推动，最后，通过人的正常咳嗽反射从气管内咳出排出体外，当气管、支气管和肺受到有害因素的刺激或致病菌感染而发生炎症时，呼吸道的粘膜充血、水肿，大量炎性细胞浸润，血管扩张，渗出增加，粘液分泌增多，产生一些变性坏死组织细胞，滞留支气管内，粘液和这些变性坏死的组织细胞就构成了痰。正常人一般不咳痰或者仅有少量泡沫样痰或粘液痰。当呼吸道病变，呼吸道粘膜收到刺激，分泌物增多，痰也增多。痰液中的细菌病毒等病原微生物核酸是呼吸道感染等疾病分子诊断的重要标本。从呼吸道痰液脱落细胞中提取的病原微生物核酸通过分子生物学检测手段进行基因检测，可用于呼吸道感染的快速诊断。
[0003]肺泡灌洗液是应用纤维支气管镜对支气管以下肺段和亚肺段进行灌洗后，采集肺泡表面衬液可获得肺泡灌洗液，对其进行实验室检查可为临床诊断、鉴别诊断、治疗效果评价和判断预后提供参考。当肺部感染或发生病变时，肺泡灌洗液含有大量的血细胞、脓液或粘液。
[0004]传统的痰液或含痰肺泡灌洗液病原体核酸提取方法为：用氢氧化钠消化痰液，然后高速离心收集沉淀，用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀2次，离心收集菌体，再利用高温煮沸，裂解核酸，然后高速离心，取上清为致病的核酸。此过程需要反复离心，操作复杂，在消化和提取的过程中损失大量核酸，同时杂质去除率低。而且这种方法不适用于痰液中病原体RNA的提取，不具有通用性，限制了临床上通过痰液或含痰肺泡灌洗液进行呼吸道感染等疾病的临床诊断。
[0005]此外，含痰样本中的核酸(尤其是RNA)极不稳定，通常在温室条件下数小时就被降解。然而在临床检测中，往往不能及时处理和检测痰液样本中的核酸，因此专利技术一种能够快速充分液化痰液同时有效保护样本核酸的方法十分必要。目前已公开的关于痰液液化及核酸保护的专利技术较多。然而，这些方法普遍存在成分复杂、成本高、样本混匀及液化不充分等问题。
[0006]含痰样本具有粘度大、蛋白多、不易液化、易成团等特点，将痰液加入常规液体保护剂后，痰液易与保护剂分层，保护剂与痰液样本接触面有限，液化时间长。有些专利涉及的保护剂成分比较复杂，如含有防腐剂、缓冲剂、螯合剂、酶抑制剂、固定剂等，保护剂成分多且成本高，不适合临床广泛使用。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术提供了病毒核酸样品处理液、试剂、提取方法及其应用。本专利技术相比较于传统痰液的病毒提取方法，本方法痰液病毒核酸提取无NaOH液化步骤，不对病毒
RNA核酸产生降解或破坏。本专利技术痰液病毒核酸提取方法，回收纯化的核酸，可用于病毒核酸的检测，包括PCR、NASBA、LAMP、RPA等，相比较于传统痰液病毒核酸提取方法，具有病毒核酸回收率高、用时少、操作方便、易于临床推广的特点。
[0008]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了样品处理液，包括组分1和组分2；上述组分1包括液化缓冲液，上述液化缓冲液包括：0.5~1.5mg/mL蛋白酶K；上述组分2包括样品保存液，上述样品保存液包括如下组分：Tris
‑
HCl10~25mMTritonX
‑
1000.1~0.5%（v/v）DTT1~10mMBSA0.5~1mg/mLDMSO0.2~0.5%（v/v）乙酰半胱氨酸0.1~0.2MTCEP
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HCl2.5~10mM。
[0009]在本专利技术的一些实施方案中，组分1具有液化痰液、组分2具有保存病毒核酸的作用。
[0010]本专利技术还提供了提取试剂，包括组分3至组分6；上述组分3包括oligodT
14
‑
20
磁珠和无oligodT
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磁珠；上述oligodT
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磁珠与上述无oligodT
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磁珠的体积比为3:1；上述组分4包括裂解保护液，上述裂解保护液包括如下组分：十二烷基硫酸锂0.01~0.05%（w/w）异硫氰酸胍0.5~1.5MTris0.01~0.1MNaCl0.1~0.2MTritonX
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1000.5~3%（v/v）；上述组分5包括清洗液，上述清洗液包括：0.05~0.2%(v/v)TritonX
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100、0.05~0.2MKCl；上述组分6包括洗脱液，上述洗脱液包括10~100 mM Tris、1~10 mM EDTA。
[0011]本专利技术还提供了病毒核酸提取试剂，包括上述的样品处理液和/或上述的提取试剂。
[0012]本专利技术还提供了病毒核酸的提取方法，以上述的病毒核酸提取试剂与待测样本混合；上述混合不包括NaOH液化和/或乙醇清洗。
[0013]在本专利技术的一些实施方案中，上述的提取方法中上述混合包括：S1：取上述待测样本与上述的组分1混合，孵育，离心后，与上述的组分2混合，得到样品；S2：取S1中获得的上述样品与上述的组分3和组分4混合，孵育后，与上述的组分5和组分6混合。
[0014]在本专利技术的一些实施方案中，上述的提取方法S1中上述待测样本、上述组分1和上
述组分2的体积比为3:3:1。
[0015]在本专利技术的一些实施方案中，上述的提取方法S1中上述孵育的温度为37~42℃，S2中上述孵育的温度为20~25℃。
[0016]本专利技术还提供了，上述的样品处理液、上述的提取试剂和/或上述的病毒核酸提取试剂在制备病毒核酸提取和/或检测试剂盒中的应用；上述病毒包括新型冠状病毒COVID
‑
19。
[0017]本专利技术还提供了病毒提取和/或检测的试剂盒，包括上述的样品处理液、上述的提取试剂和/或上述的病毒核酸提取试剂以及可接受的助剂或载体。
[0018]在本专利技术的一些实施方案中，上述的试剂盒还包括：引物组、探针组和/或病毒扩增试剂中的一种或多种。
[0019]在本专利技术的一些实施方案中，上述试剂盒还包括如下引物探针组合中的一种或两者以上：引物组合一：根据COVID
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19的N基因序列获得的RT
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LAMP的引物组合（1）、N1
‑
F3：具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；和（2）、N1
‑
B3：具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；和（3）、N1
‑
FIP：具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；和（4）、N1
‑
BIP：具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；和（5）、N1
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LF：具有如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；和（6）、N1
‑
LB：具有如SEQ ID 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.样品处理液，其特征在于，包括组分1和组分2；所述组分1包括液化缓冲液，所述液化缓冲液包括：0.5~1.5mg/mL蛋白酶K；所述组分2包括样品保存液，所述样品保存液包括如下组分：Tris
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HCl10~25mMTritonX
‑
1000.1~0.5%（v/v）DTT1~10mMBSA0.5~1mg/mLDMSO0.2~0.5%（v/v）乙酰半胱氨酸0.1~0.2MTCEP
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HCl2.5~10mM。2.提取试剂，其特征在于，包括组分3至组分6；所述组分3包括oligodT
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20
磁珠和无oligodT
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20
磁珠；所述oligodT
14
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磁珠与所述无oligodT
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磁珠的体积比为3:1；所述组分4包括裂解保护液，所述裂解保护液包括如下组分：十二烷基硫酸锂0.01~0.05%（w/w）异硫氰酸胍0.5~1.5MTris0.01~0.1MNaCl0.1~0.2MTritonX
‑
1000.5~3%（v/v）；所述组分5包括清洗液，所述清洗液包括：0.05~0.2%(v/v)TritonX
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100、0.05~0.2MKCl；所述组分6包...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭弘妍，王辉，李雅婷，赵建晴，程京，
申请(专利权)人：广州国家实验室，
类型：发明
国别省市：