用于空间转录组测序的组织透化方法技术

本发明专利技术提供一种用于空间转录组测序的组织透化方法，包括组织贴片、固定及染色，组织透化，荧光cDNA合成，组织移除和荧光扫描成像等步骤。利用该方法可对组织样本进行透化，逆转录及组织移除，并根据荧光信号选择最优透化条件。该方法与传统方法相比，优点在于兼容范围广，操作性强，重复性好，成本低等。该方法主要应用于空间转录组的组织优化流程。应用于空间转录组的组织优化流程。

【技术实现步骤摘要】
用于空间转录组测序的组织透化方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地说，涉及一种用于空间转录组测序的组织透化方法。

技术介绍

[0002]在多细胞生物中，单个细胞的基因表达严格按特定的时间和空间顺序发生，即基因表达具有时间特异性和空间特异性。时间特异性可以通过对不同时间点的样本取材，使用单细胞转录组测序技术来解析时间维度上细胞类型和基因表达模式。空间特异性信息则相对较难获得。常规转录组测序和单细胞转录组测序都难以还原细胞所处的原始位置信息。传统的原位杂交技术又很难实现高通量检测。因此发展空间转录组技术实现细胞的位置信息的保留尤为必要。
[0003]空间基因组学仍是一个新兴发展领域，市场主要有三个商业化的参与者10x Genomics，Nanostring，Readcoor。2019年12月，10x Genomics宣布收购Spatial一年之际，Visium平台正式推出，成为了第一款走入商业化进程的空间转录组产品。它的优势在于组织兼容性强，无偏性捕获所有mRNA；易与其他病理分析的方法和工具整合，也易和NGS流程整合，平台具有较强的扩展性，容易被接受整合进现有的实验室。NanoString于2019年推出GeoMx DSP，用于组织切片空间原位高通量蛋白和基因的表达检测。它与10x Visium相比，工作流程更加自动化，对于样本质量要求低，无需高质量的RNA，同时适用于FFPE，但它是一种灵活性较低的专用平台，抗体和探针的设计明确针对肿瘤免疫和神经科学的具体应用。ReadCoor最早在2020年的AGBT大会上推出，它相较于10X平台最大的优势在于无与伦比的细胞分辨率。但以上三种平台的共性为价格昂贵，其中广泛应用的10x Visium平均市场价格为3.5万元一个样本。
[0004]组织优化玻片用于摸索某个组织类型的最佳透化时间。组织优化玻片上的oligo没有spatial barcode，也不会构建测序文库，当合成一链cDNA时，在反应体系中加入带有荧光基团的核苷酸，这样合成出来的cDNA就带有荧光。通过荧光强度可以反映出组织中mRNA释放量的多少，从而确定某个组织类型最佳的透化时间。通常情况下，选择荧光信号最强、RNA扩散最少、内部组织结构最清晰的时间点作为最佳透化时间点。如果发现荧光信号发生扩散，说明透化时间过长。在确定最佳透化时间之后，就可以使用最佳透化时间开始空间基因表达的正式实验。因此，合适的组织透化工艺条件成为实现该技术的关键。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种用于空间转录组测序的组织透化方法。
[0006]为了实现本专利技术目的，本专利技术提供一种用于空间转录组测序的组织透化方法，包括以下步骤：
[0007](1)组织贴片、固定及染色：将新鲜冷冻组织切片贴于生物芯片指定区域，然后将芯片放入固定液中固定，并进行HE染色及扫描仪成像；
[0008]其中，所述生物芯片带有mRNA捕获探针；
[0009](2)组织透化：将步骤(1)所得芯片放入组织透化液中孵育一段时间后，去除组织透化液(然后向芯片孔内加入0.1
×
SSC溶液)；
[0010]其中，所述组织透化液的组成如下：组织透化原液60μl+0.1M HCl 5940μl；所述组织透化原液的配制方法为：将0.1g胃蛋白酶溶于1000μl无核酶水中；
[0011](3)荧光cDNA合成：(去除芯片孔内0.1
×
SSC溶液)向芯片孔内加入含有荧光基团的cDNA合成试剂进行cDNA合成；
[0012](4)组织移除：去除cDNA合成试剂，向芯片孔内加入组织移除液；
[0013](5)荧光扫描成像。
[0014]优选地，步骤(1)中所述固定液为甲醇或甲醛。固定条件为：
‑
20℃固定30min。
[0015]步骤(2)进行组织透化的温度为37℃。
[0016]步骤(3)所述含有荧光基团的cDNA合成试剂的组成如下，按每孔计：5
×
反转录缓冲液20μl，200U/μl反转录酶5μl，10mM dNTPs 15μl，1mM Cy3
‑
dCTP 0.5μl，40U/μl RNaseOUT 5μl，无核酶水补齐至100μl。
[0017]cDNA合成的条件为：42℃反应1.5h。
[0018]步骤(4)所述组织移除液的组成如下：20mg/ml蛋白酶K12.5μl和PKD缓冲液87.5μl。
[0019]组织移除的条件为：56℃反应1h。
[0020]进一步地，在进行荧光扫描成像之前，还包括对组织移除后的芯片进行梯度洗涤的步骤，具体如下：
[0021]1)用50℃预热的含0.1％SDS的2
×
SSC溶液冲洗芯片10
‑
20次；
[0022]2)用0.2
×
SSC溶液冲洗芯片10
‑
20次；
[0023]3)用0.1
×
SSC溶液冲洗芯片10
‑
20次。
[0024]借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：
[0025](一)本专利技术提供一套基于空间透化芯片进行组织样本透化的测试流程，利用3D病理切片扫描仪对结果进行判读的方法及其应用。利用该方法可对组织样本进行透化，逆转录及组织移除，并根据荧光信号选择最优透化条件。该方法与传统方法相比，优点在于兼容范围广，操作性强，重复性好，成本低等。该方法主要应用于空间转录组的组织优化流程。
[0026](二)操作简便：试剂混合液组分简单，操作性强。
[0027](三)成本低：整个测试芯片及试剂相较进口产品，成本节省50％以上。
附图说明
[0028]图1为本专利技术较佳实施例中大鼠胚胎样本透化5分钟的荧光信息扫描图。
[0029]图2为本专利技术较佳实施例中大鼠胚胎样本透化8分钟的荧光信息扫描图。
[0030]图3为本专利技术较佳实施例中大鼠胚胎样本透化9分钟的荧光信息扫描图。
[0031]图4为本专利技术较佳实施例中大鼠胚胎样本透化12分钟的荧光信息扫描图。
[0032]图5为本专利技术空间转录组透化时间优化芯片的参数及捕获探针示意图。从图可见芯片目标区域密布捕获探针。
[0033]图6为本专利技术空间转录组透化时间优化芯片捕获探针结构示意图。其中，寡核苷酸
链由三部分组成，从玻片表面向外依次为：连接序列区、质检探针结合区和mRNA捕获区(mRNA捕获探针)。
[0034]图7为本专利技术空间转录组透化时间优化芯片透化荧光结果示意图。
[0035]图8为本专利技术空间转录组组织透化优化方法的流程示意图。
具体实施方式
[0036]本专利技术提供一种成本低、操作性强的组织透化优化方法，将新鲜冷冻组织切片贴在透化芯片上进行固定及染色后置入卡夹，使用配置好的透化酶选择时间梯度透化组织，接下来去本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于空间转录组测序的组织透化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)组织贴片、固定及染色：将新鲜冷冻组织切片贴于生物芯片指定区域，然后将芯片放入固定液中固定，并进行HE染色及扫描仪成像；其中，所述生物芯片带有mRNA捕获探针；(2)组织透化：将步骤(1)所得芯片放入组织透化液中孵育一段时间后，去除组织透化液；其中，所述组织透化液的组成如下：组织透化原液60μl+0.1M HCl 5940μl；所述组织透化原液的配制方法为：将0.1g胃蛋白酶溶于1000μl无核酶水中；(3)荧光cDNA合成：向芯片孔内加入含有荧光基团的cDNA合成试剂进行cDNA合成；(4)组织移除：去除cDNA合成试剂，向芯片孔内加入组织移除液；(5)荧光扫描成像。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述固定液为甲醇或甲醛；固定条件为：
‑
20℃固定20
‑
30min。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)进行组织透化的温度为37℃。4.根据权利要求1所述的，其特征在于，步骤(3)所述含有荧光基团的cDNA合成试剂的组成如下，按每孔计：5
×
反...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑洪坤，刘敏，张梦龙，刘晨阳，
申请(专利权)人：北京百迈客生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：