浸润性宫颈鳞癌精准分期的检测引物、检测探针、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种浸润性宫颈鳞癌精准分期的检测引物、检测探针、试剂盒及方法，所述检测引物包括：针对HPV16检测的SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7、针对HPV18检测的SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、针对HPV33检测的SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13、针对HPV52检测的SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16、针对HPV58检测的SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19。本发明专利技术可以明确ctHPV DNA载量与宫颈癌发生发展的相关性，从而实现了精准区分浸润性宫颈鳞癌癌前病变、宫颈癌早期和宫颈癌晚期。期和宫颈癌晚期。期和宫颈癌晚期。

【技术实现步骤摘要】
浸润性宫颈鳞癌精准分期的检测引物、检测探针、试剂盒及方法


[0001]本专利技术属于医疗检测
，更具体地，本专利技术涉及一种基于外周血ctHPV DNA载量的浸润性宫颈鳞癌精准分期的检测引物、检测探针、试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]宫颈癌是全球女性的第四大常见癌症，其中鳞癌占70％左右，腺癌占20％左右，腺鳞癌占10％左右。宫颈癌发病过程依次分为：增生、非典型增生、原位癌和浸润癌，其中宫颈非典型增生及宫颈原位癌统称为CIN。另外根据国际妇产科联盟(FIGO)的宫颈癌临床分期标准，宫颈浸润癌通常分期1到4对应着罗马数字I、II、III和IV，其中IA1
‑
IB2期是早期宫颈癌，IB3
‑
IVA是晚期宫颈癌。
[0003]99.7％宫颈癌都与人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)持续感染有关，HPV是一种环状双链DNA病毒，现有200多个亚型。HPV基因组分为3个区：非编码区、早期转录区(包括E1、E2、E4、E5、E6、E7基因)、晚期转录区(包括L1、L2基因)。
[0004]目前，细胞学/HPV检测、阴道镜检查、宫颈活组织病理检查是临床诊断宫颈癌和癌前病变的主要方法，其中阴道镜或直视下的宫颈组织学活检病理检查是最终确诊的金标准，但是阴道镜或直视下的宫颈组织学活检病理检查目前尚缺乏统一的国际性图像诊断标准，检查过程受临床医生主观性判断和临床经验的影响，且宫颈活组织病理检查属于有创性穿刺检查，存在创口感染风险，会对患者造成一定的创伤，易导致患者抵触心理。
[0005]随着新技术的发展，陆续出现基于子宫颈脱落细胞基因检测的宫颈癌分期方法和基于数字PCR检测外周血ctHPV DNA的宫颈癌分期方法。基于子宫颈脱落细胞基因检测的宫颈癌分期方法，从脱落细胞的角度阐明了P53、P16与宫颈癌发生发展的相关性，为宫颈癌的分期诊断提供了新的依据，但是，该方法只能区分癌前病变、宫颈癌，无法进一步对宫颈癌进行精准分期。基于数字PCR检测外周血ctHPV DNA的宫颈癌分期方法，从外周血提取循环肿瘤DNA(ctDNA)，基于HPV病毒序列的E7区域设计特异性引物和探针，利用数字PCR技术检测ctHPV DNA载量与宫颈癌发生发展的相关性，但是该方法只能在宫颈癌晚期患者中有效检出ctHPV DNA，无法精准区分宫颈癌早期和宫颈癌晚期。
[0006]因此，探寻一种可以做到癌前病变、宫颈癌早期和宫颈癌晚期的精准分期的方法非常有意义。

技术实现思路

[0007]基于此，本专利技术的目的在于提供一种浸润性宫颈鳞癌精准分期的检测引物、检测探针、试剂盒及方法。
[0008]实现上述专利技术目的的技术方案包括如下。
[0009]本专利技术的第一方面，提供了一种浸润性宫颈鳞癌精准分期的检测引物，包括：针对HPV16检测的SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7、针对HPV18检测的SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、
针对HPV33检测的SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13、针对HPV52检测的SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16、针对HPV58检测的SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19。
[0010]本专利技术的第二方面，提供了一种浸润性宫颈鳞癌精准分期的检测探针，包括：针对HPV16检测的SEQ ID NO.8、针对HPV18检测的SEQ ID NO.11、针对HPV33检测的SEQ ID NO.14、针对HPV52检测的SEQ ID NO.17、针对HPV58检测的SEQ ID NO.20。
[0011]本专利技术的第三方面，提供了一种浸润性宫颈鳞癌精准分期的检测试剂盒，所述试剂盒包括上述检测引物以及检测探针。
[0012]本专利技术的第四方面，提供了一种浸润性宫颈鳞癌精准分期的检测方法，提取待测血浆样本的ctDNA，使用上述检测引物和检测探针，采用ddPCR进行检测。
[0013]在本专利技术中，根据HPV16/18/33/52/58五种高危分型，选择低保守性区域E6设计特异性检测引物和检测探针，采用数字PCR技术检测外周血中的ctHPV DNA载量，可以明确ctHPV DNA载量与宫颈癌发生发展的相关性，从而实现了精准区分浸润性宫颈鳞癌癌前病变、宫颈癌早期和宫颈癌晚期。
附图说明
[0014]图1为本专利技术HPV16/18/33/52/58五种高危分型的序列比对结果。
[0015]图2为本专利技术试验例中FAM通道的信号结果。
[0016]图3为本专利技术试验例中HEX通道的信号结果。
[0017]图4为本专利技术试验例中FAM通道微滴数计算结果。
[0018]图5为本专利技术对比例中临床样品的检测结果。
具体实施方式
[0019]为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述。本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术公开内容的理解更加透彻全面。
[0020]除非另有定义，本专利技术所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本专利技术。本专利技术所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0021]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook等人，分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2013)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
[0022]在本专利技术中，首先根据中国的HPV感染流行病学特点，分析了HPV16/18/33/52/58五种高危分型的差异序列区域(序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示，序列比对结果如图1所示)，意外发现针对低保守性区域E6设计特异性检测引物和检测探针，采用数字PCR技术检测外周血中的ctHPV DNA载量(以非侵入方式获取样本，避免了通过妇科检查手段采样的方式所造成的创伤，与阴道镜或直视下的宫颈组织学活检病理检查相比，检测外周血ctHPV DNA载量具有无创或微创的特点)，与传统的针对区域E7设计的检测引物和检测
探针相比，采用本专利技术的特异性检测引物和检测探针进行检测，可以明确ctHPV DNA载量与宫颈癌发生发展的相关性，从而实现了精准区分浸润性宫颈鳞癌癌前病变、宫颈癌早期和宫颈癌晚期。且本专利技术突破性的仅针对传统认为早期转录区的E6设计特异性检测引物和检测探针，不仅能检测浸润性宫颈鳞癌，还能区分癌前病变、宫颈癌早期和宫颈癌晚期。
[0023]>HPV16(SEQ ID NO.1)
[0024]atgtttcaggacccacaggagcgacccagaaagttaccacag本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种浸润性宫颈鳞癌精准分期的检测引物，其特征在于，包括：针对HPV16检测的SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7、针对HPV18检测的SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、针对HPV33检测的SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13、针对HPV52检测的SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16、针对HPV58检测的SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19。2.根据权利要求1所述的浸润性宫颈鳞癌精准分期的检测引物，其特征在于，还包括针对内参基因FGFR1检测的SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22。3.一种浸润性宫颈鳞癌精准分期的检测探针，其特征在于，包括：针对HPV16检测的SEQ ID NO.8、针对HPV18检测的SEQ ID NO.11、针对HPV33检测的SEQ ID NO.14、针对HPV52检测的SEQ ID NO.17、针对HPV58检测的SEQ ID NO.20。4.根据权利要求3所述的浸润性宫颈鳞癌精准分期的检测探针，其特征在于，所述检测探针的5'端修饰有荧光标记FAM。5.根据权利要求3所述的浸润性宫颈鳞癌精准分期的检测探针，其特征在于，还包括针对内参基...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈涛，孙如美，刘栋，吴涛，程雅婷，
申请(专利权)人：广州市金域转化医学研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：