一种PCR引物设计模板筛选的方法及应用技术

本发明专利技术提供一种PCR引物设计模板筛选的方法及应用，涉及分子生物学检测技术领域。本发明专利技术的方法包括：从数据库获取目标种属的基因组，所述基因组中包括已知的变异株的基因组序列，进行多序列全局对比并分析基因组变异；根据目标种属基因组比对文件，确定基因组中的高度保守序列；计算高度保守序列的GC％与碱基随机性；以高度保守序列的GC％与碱基随机性作为筛选参数，对高度保守序列的引物设计模板进行筛选。该方法可系统高效地筛选PCR引物设计模板，采用该模板设计得到的PCR引物具有高特异性和高效率的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种PCR引物设计模板筛选的方法及应用
本专利技术涉及分子生物学检测
，特别是涉及一种PCR引物设计模板筛选的方法和应用。
技术介绍
随着基因测序技术的发展，越来越多物种基因组完成测序，基因组DNA/RNA序列作为鉴别物种的分子标记已被广泛认可。PCR扩增技术是DNA序列分析的基础，具有特异性强、准确率高、可重复性强等特点，已经广泛应用于精准医学与病原微生物鉴定。PCR技术则非常依赖高度特异性的PCR引物。高特异性的PCR引物要求：一、待鉴别物种的目的基因与其他物种基因序列相似，因此引物设计模板必须保证具有物种的特异性；二、为了保证能够检出发生变异的种属，引物设计模板需要设置在基因的保守区。这两个方面的矛盾难以统一。因此，PCR引物的设计具有较高要求。目前，筛选合适的PCR引物设计模板过程往往依赖于经验、文献检索等不系统的方法，该过程需要不断试错才能获得特异性与扩增效率均理想的引物。这些方法存在效率低、耗时长、引物扩增效率与特异性难以均衡的不足。
技术实现思路
基于此，有必要针对上述问题，提供一种PCR引物设计模板筛选的方法，该方法可系统高效地筛选用于鉴定生物种属的PCR引物设计模板，采用该模板设计得到的PCR引物具有高特异性和高效率的特点。一种PCR引物设计模板筛选的方法，包括以下步骤S1、从数据库获取目标种属的基因组，所述基因组中包括已知的变异株的基因组序列，进行多序列全局对比与变异分析；S2、根据目标种属基因组比对文件，确定基因组中的高度保守序列；>S3、计算高度保守序列的GC％(GC百分比)与碱基随机性；GC％的计算公式为：碱基随机性的计算方式如下：设定该段序列长度为L，序列中的碱基数量为n；设定第1位碱基的随机性k1设为1，若i+1位碱基与第i位碱基相同，则赋予第i+1位碱基的随机性ki+1是1；反之，若i+1位碱基与第i位碱基不同，则赋予第i+1位碱基的随机性ki+1是-1；该段序列的随机性归一化的随机性S4、以GC％与碱基随机性作为筛选参数，对高度保守序列的引物设计模板进行筛选。上述PCR引物设计模板筛选方法，先通过将待鉴别物种包含已知变异株的基因组序列进行全局对比，确定高度保守序列，再引入碱基随机性参数以评估引物设计模板的碱基分布均衡性，选择碱基分布随机性好的引物模板，碱基分布随机性越好则多样性也就越好，引物配对的特异性越高。本专利技术的方法，改变过往，选择PCR引物设计模板过程依赖于经验、文献检索等效率低、耗时长的方法，致使引物扩增效率与特异性难以均衡的问题。可以理解的，在当待鉴别物种为RNA时，将GC％的计算公式中的T置换为U。在其中一个实施例中，所述步骤S1中，获取目标种属的基因组时，应尽量多地纳入已知的变异株的基因组序列。在其中一个实施例中，所述步骤S1中，利用bwa+samtools+picardtools+GATK流程分析基因组变异。在其中一个实施例中，所述步骤S2中，确定基因组中高度保守序列的方法为：1)分析基因组范围内的所有基因变异，确定基因组序列的每个碱基的等位基因变异与等位基因频率；2)选择序列大小≥200bp的某区段序列，若该区段序列的碱基中发生变异的等位基因≤50个碱基，则定义该区段序列为高度保守序列。需要说明的是，区段序列的变异频率＝变异等位基因的数量/分析的病毒株数量。在其中一个实施例中，所述步骤S2和S3之间还设有步骤S2.1：分析所述高度保守序列的特异性，排除特异性＜100％的序列，保留特异性为100％的序列。在其中一个实施例中，所述步骤S2.1中，利用BLAST工具分析(设定一致性identity>90％)所述高度保守序列的特异性，方法为：1)利用Blast软件分析步骤S2筛选出来的保守序列；2)由Blast输出的结果(output)中存在目标物种之外的物种片段(hit)，则显示该段序列的特异性<100％，予以排除；保留特异性为100％的序列。在其中一个实施例中，所述步骤S4中，以GC％与碱基随机性作为筛选参数，保留同时满足以下条件的序列作为引物设计模板：1)GC％符合目标物种平均基因组GC含量±10％的序列，2)将步骤S3所得高度保守序列按Rs从高到低进行排序，Rs位于末位25％以内的序列。GC％越接近0.5，表明该段DNA序列的碱基均衡性越好。碱基随机性显示同聚碱基，如多个连续的G的发生概率；碱基分布越随机，其多样性越好，引物配对的特异性越高。Rs越小，则显示该段序列的碱基随机性越好。在其中一个实施例中，所述步骤S4后还有步骤S5：以步骤S4筛选得到的高度保守序列作为引物设计模板，进行引物设计，将得到的引物配对组成引物对，进行PCR扩增测试，以PCR产物的特异性和丰度作为评价，选择PCR产物单一的引物模板，即为筛选得到的PCR引物设计模板。PCR扩增测试中，如果引物特异性扩增，则PCR产物单一；若引物特异性差，则产生非特异性产物，例如引物二聚体等。PCR产物的丰度是评价引物扩增效率高低的重要参数。本专利技术还提供一种PCR引物设计方法，包括以下步骤：(1)采用上述方法筛选的PCR引物设计模板；(2)根据上述PCR引物设计模板设计PCR引物。上述PCR引物设计方法，以本专利技术的PCR引物设计模板筛选方法对模板进行筛选，设计得到的PCR引物可用于鉴定某一种系生物，且具有特异性高、检测效率高的优点。在其中一个实施例中，所述步骤(2)中，设计引物参数为：引物长度为25～35bp，碱基序列GC％为30～70％，产物长度为120～200bp。本专利技术另一方面还提供一种上述方法在设计用于鉴定SARS-CoV-2病毒株的PCR引物中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术的PCR引物设计模板筛选方法，先通过将待鉴别物种包含已知变异株的基因组序列进行全局对比，确定高度保守序列，再引入碱基随机性参数以评估引物设计模板的碱基分布均衡性，选择碱基分布随机性好的引物模板，碱基分布随机性越好则多样性也就越好，引物配对的特异性越高。该方法改变过往，选择PCR引物设计模板过程依赖于经验、文献检索等效率低、耗时长的方法，致使引物扩增效率与特异性难以均衡的问题。本专利技术的PCR引物设计方法，以本专利技术的PCR引物设计模板筛选方法对模板进行筛选，设计得到的PCR引物可用于鉴定某一种系生物，且具有特异性高、检测效率高的优点。附图说明图1为实施例中以模板ID为6的引物设计模板设计得到的引物序列对应的PCR扩增产物凝胶电泳结果；图2为实施例中以模板ID为15的引物设计模板设计得到的引物序列对应的PCR扩增产物凝胶电泳结果；图3为实施例中以模板ID为17的引物设计模板设计得到的引物序列对应的PCR扩增产物凝胶电泳结果；图4为实施例中以模板ID为9的引物设计模板设计得到的引物序列对应的PCR扩增产物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种PCR引物设计模板筛选的方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1、从数据库获取目标种属的基因组，所述基因组中包括已知的变异株的基因组序列，进行多序列全局对比并分析基因组变异；/nS2、根据目标种属基因组比对文件，确定基因组中的高度保守序列；/nS3、计算高度保守序列的GC％与碱基随机性；GC％的计算公式为：

【技术特征摘要】
1.一种PCR引物设计模板筛选的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、从数据库获取目标种属的基因组，所述基因组中包括已知的变异株的基因组序列，进行多序列全局对比并分析基因组变异；
S2、根据目标种属基因组比对文件，确定基因组中的高度保守序列；
S3、计算高度保守序列的GC％与碱基随机性；GC％的计算公式为：碱基随机性的计算方式如下：
设定该段序列长度为L，序列中的碱基数量为n；设定第1位碱基的随机性k1设为1，若i+1位碱基与第i位碱基相同，则赋予第i+1位碱基的随机性ki+1是1；反之，若i+1位碱基与第i位碱基不同，则赋予第i+1位碱基的随机性ki+1是-1；该段序列的随机性归一化的随机性
S4、以GC％与碱基随机性作为筛选参数，对高度保守序列的引物设计模板进行筛选。


2.根据权利要求1所述的方法，所述步骤S1中，利用bwa+samtools+picardtools+GATK流程分析基因组变异。


3.根据权利要求1所述的方法，所述步骤S2中，确定基因组中高度保守序列的方法为：
1)分析基因组范围内的所有基因变异，确定基因组序列的每位碱基的等位基因变异与等位基因频率；
2)选择序列大小≥200bp的某区段序列，若该区段序列的碱基中发生变异的等位基因≤50个碱基，则定义该区段序列为高度保守序列。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2和S3之间还设有步骤S2.1：分析所述高度保守序列的特异性，排除特异性<100％的序列，保留特异性为100％的序列。


5.根据权利要求4所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄晓强，蒙裕欢，欧小华，缪夏萍，李桂彬，范喜杰，严慧，于世辉，
申请(专利权)人：广州市金域转化医学研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44