染色体和单基因病同步产前筛查的方法、试剂盒和分析系统技术方案

本发明专利技术提供了一种用于胎儿染色体拷贝数变异、胎儿染色体微缺失/微重复、和/或显性单基因突变的无创产前筛查的检测方法、试剂盒、及其系统。以及本发明专利技术还提供了一种靶向捕获探针的设计方法，所述方法用于胎儿无创产前筛查。与现有的无创产前筛查检测方法相比，能够扩大临床基因检测适用范围、提高检测准确性。

【技术实现步骤摘要】
染色体和单基因病同步产前筛查的方法、试剂盒和分析系统
本专利技术提供涉及一种用于胎儿染色体拷贝数变异、胎儿染色体微缺失/微重复、和/或显性单基因突变的无创产前筛查的检测方法、试剂盒、及其系统，以及一种用于胎儿无创产前筛查的靶向捕获探针的设计方法。
技术介绍
出生缺陷是指胎儿在母体子宫内的生长发育异常，导致出生时已存在的先天性缺陷。我国人口众多，每年新增出生缺陷的人数约为90万，出生缺陷的发生率约为5.6％[1]。出生缺陷是造成婴幼儿死亡和残疾的主要原因，已成为影响人民群众健康水平的重大公共卫生问题，社会和经济负担沉重。遗传因素是造成出生缺陷的重要原因，染色体异常和单基因遗传病均可引起多种类型的出生缺陷。染色体异常主要是拷贝数异常和结构性异常，最常见的拷贝数异常是染色体非整倍体异常，出生时发病率约为1/160[2]。染色体非整倍体是指染色体数目与二倍体基因组(46、XX或46、XY)之间的差异，通常是一条染色体的冗余或缺失。临床上最常见的染色体非整倍体遗传病包括21号染色体(T21，唐氏综合征)、18号染色体(T18，爱德华综合征)和13本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于胎儿无创产前筛查的检测方法，其包括以下步骤：/n(1)检测和计算胎儿游离核酸百分比(ff)；/n(2)在待检测染色体中选择一个或多个SNP位点，其中所述SNP位点在人群中分布相对较高的等位基因称为野生型(B)，在人群中分布相对较低的等位基因称为突变型(A)，纯合野生基因型为BB，纯合突变基因型为AA，杂合基因型为AB；/n(3)使用针对所述一个或多个SNP位点的靶向捕获探针捕获母体外周血游离DNA(cfDNA)，扩增后进行测序，测得等位基因A的读数NA，以及该位点的测序深度N；/n(4)计算胎儿在各SNP位点可能为染色体拷贝数正常或不同拷贝数异常情况的概率；根据每一个SNP位点实测...

【技术特征摘要】
1.一种用于胎儿无创产前筛查的检测方法，其包括以下步骤：
(1)检测和计算胎儿游离核酸百分比(ff)；
(2)在待检测染色体中选择一个或多个SNP位点，其中所述SNP位点在人群中分布相对较高的等位基因称为野生型(B)，在人群中分布相对较低的等位基因称为突变型(A)，纯合野生基因型为BB，纯合突变基因型为AA，杂合基因型为AB；
(3)使用针对所述一个或多个SNP位点的靶向捕获探针捕获母体外周血游离DNA(cfDNA)，扩增后进行测序，测得等位基因A的读数NA，以及该位点的测序深度N；
(4)计算胎儿在各SNP位点可能为染色体拷贝数正常或不同拷贝数异常情况的概率；根据每一个SNP位点实测到cfDNA的突变基因型百分比(A％)、胎儿游离核酸百分比(ff)和母亲在此位点的基因型，分别计算胎儿是整倍体或者非整倍体的概率值；同一染色体所有有效SNP位点概率总和最大值为胎儿判读的核型；
计算的胎儿核型H包括：D(二倍体型，disomy)、MI(母源三体综合症I型，maternaltrisomytypeI)、MII(母源三体综合症II型，maternaltrisomytypeII)、PI(父源三体综合症I型，paternaltrisomytypeI)、PII(父源三体综合症II型，paternaltrisomytypeII)、LM(母源微缺失，maternaldeletion)和LP(父源微缺失，paternaldeletion)；
胎儿在各SNP位点的核型概率是通过π加权的有条件贝塔二项式分布概率的线性组合并取对数得出，计算公式为：



i为第i个有效SNP位点；
N为该SNP位点的测序深度；pAi是胎儿为整倍体或非整倍体在不同基因座上突变型的下一代测序(NGS)读数百分比的期望值；在胎儿为不同核型时，pAi在不同基因座H上的基因型不同，其期望值也各不相同，具体不同基因座H的pAi见表1；
α是pAi根据在测序中实际值选取的离散参数；因其受实验条件的影响实测值会偏离期望值；使用预先混合好的母子配对的参考品或者孕妇血浆样本确定α的范围为1000-5000；优选地，α值为1000、2000、3000、4000、5000；
β＝α/pAi-α
加权系数πk的计算根据胎儿不同的核型计算：



其中PATk∈{AA，AB，BB}，p(PATk)根据Hardy-Weinberg公式计算，该SNP位点的人群频率为p：
p(AA)＝p×p
p(AB)＝2×p×(1-p)
p(BB)＝(1-p)×(1-p)
p(FET)是胎儿的可能基因型，其受父亲和母亲基因型影响，在胎儿为整倍体或非整倍体时，p(FET)按照孟德尔遗传规律计算，见表2；
(5)胎儿染色体拷贝数变异的计算
在精子或者卵子产生过程中，如果被考察的某条染色体没有发生减数分裂同源重组，染色体拷贝数异常与正常概率的分布差别计算公式为：



H∈{MI，MII，PI，PII，LM，LP}
LD是该位点在整倍体核型下的概率值；
LH是该位点在非整倍体核型下的概率值；
M为该染色体有效SNP位点个数；
当此值小于检测阈值时，染色体倍数异常为阳性，检测阈值见表3。


2.根据权利要求1所述的用于胎儿无创产前筛查的检测方法，其特征在于，所述方法的步骤(5)为：
(5)胎儿染色体微缺失/微重复的计算
在精子或者卵子产生过程中，如果被考察的某条染色体发生部分缺失或者部分重复，染色体拷贝数异常与正常概率的分布差别计算公式为：



H∈{MI，MII，PI，PII，LM，LP}，0＜b1，b2＜M
b1和b2是染色体发生微缺失/微重复的起始和终止位置；
当此值小于检测阈值时，染色体倍数异常为阳性，检测阈值见表3；
或(5)显性单基因突变的计算
显性单基因突变出现在母亲是纯合野生型BB的区域，根据A的读数NA，位点的测序深度N，胎儿游离核酸百分比ff，和进行贝塔二项分布拟合计算出A读数来自胎儿的概率，并将此概率与系统噪音概率进行比较，其中：
在某个基因座上，母亲为纯和野生型BB时，胎儿来自父亲或者是新发突变的概率为：
ΔL＝log(beta-binom(ff/2，N，α，β1))-log(beta-binom(e，N，α，β2))
N是该位点的测序深度；
ff是胎儿游离核酸百分比；
α是根据在胎儿游离DNA中来自于父亲的等位基因实际测值选取的离散参数，因其受实验条件的影响实测值会偏离期望值，使用预先混合好的母子配对的参考品或者孕妇血浆样本确定α的范围为1000-5000；优选地，α值为1000、2000、3000、4000、5000；
β1＝2×α/ff-α；
e是该位点的系统错误率，系统错误率是该位点在已知的阴性标本中的突变基因型的比例；α是系统噪音实测得的离散参数，确定α的范围为1000-5000；优选地，α值为1000、2000、3000、4000、5000；
β2＝α/e-α
当ΔL大于检测阈值1时，基因突变为阳性。


3.根据权利要求1所述的用于胎儿无创产前筛查的检测方法，其特征在于，所述方法还包括：胎儿染色体微缺失/微重复的计算、显性单基因突变的计算、或胎儿染色体微缺失/微重复的计算和显性单基因突变的计算；
所述胎儿染色体微缺失/微重复的计算为：
在精子或者卵子产生过程中，如果被考察的某条染色体发生部分缺失或者部分重复，染色体拷贝数异常与正常概率的分布差别计算公式为：



H∈{MI，MII，PI，PII，LM，LP}，0＜b1，b2＜M
b1和b2是染色体发生微缺失/微重复的起始和终止位置；
当此值小于检测阈值时，染色体倍数异常为阳性，检测阈值见表3；
所述显性单基因突变的计算为：
显性单基因突变出现在母亲是纯合野生型BB的区域，根据A的读数NA，位点的测序深度N，胎儿游离核酸百分比ff，和进行贝塔二项分布拟合计算出A读数来自胎儿的概率，并将此概率与系统噪音概率进行比较，其中：
在某个基因座上，母亲为纯和野生型BB时，胎儿来自父亲或者是新发突变的概率为：
ΔL＝log(beta-binom(ff/2，N，α，β1))-log(beta-binom(e，N，α，β2))
N是该位点的测序深度；
ff是胎儿游离核酸百分比；
α是根据在胎儿游离DNA中来自于父亲的等位基因实际测值选取的离散参数，因其受实验条件的影响实测值会偏离期望值，使用预先混合好的母子配对的参考品或者孕妇血浆样本确定α的范围为1000-5000；优选地，α值为1000、2000、3000、4000、5000；
β1＝2×α/ff-α
e是该位点的系统错误率，系统错误率是该位点在已知的阴性标本中的突变基因型的比例；α是系统噪音实测得的离散参数，确定α的范围为1000-5000；优选地，α值为1000、2000、3000、4000、5000；
β2＝α/e-α
当ΔL大于检测阈值1时，基因突变为阳性。


4.根据权利要求1、2或3所述的用于胎儿无创产前筛查的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)检测和计算胎儿游离核酸百分比(ff)，
其包括以下步骤：
当母亲是纯合野生型BB时，胎儿的基因型可能为BB或者BA，对于胎儿为BA的位点，A的读数比例分布以ff/2为中心，胎儿游离核酸百分比可被所有此类型位点A的读数比例中值ffBB计算；对于母亲是纯合变异型AA的时候，胎儿的基因型可能为AA或者AB，对于胎儿为AB的位点，A的读数比例分布以ff/2为中心，胎儿游离核酸百分比可被所有此类型位点B的读数比例中值ffAA计算；胎儿游离核酸百分比(ff)的计算为：
ff＝(ffAA+ffBB)/2。


5.根据前述权利要求中任一项所述的用于胎儿无创产前筛查的检测方法，其特征在于，其中，待检测的SNP位点是包含SNP位点的所有染色体中的一个或多个；优选地，所述待检测的SNP位点是染色体13，18，21，22，X和Y中的一个或多个。


6.根据前述权利要求中任一项所述的用于胎儿无创产前筛查的检测方法，其特征在于，其中，针对父母生殖细胞产生过程中可能发生一次染色体重组的情况，染色体SNP位点概率总和的公式为：






H1，H2∈{MI，MII，PI，PII}当上述两个计算结果之一小于检测阈值时，染色体倍数异常为阳性，检测阈值见表3。


7.根据前述权利要求中任一项所述的用于胎儿无创产前筛查的检测方法，其特征在于，其中，针对父母生殖细胞产生过程中可能发生一次或者两次染色体重组的情况，染色体SNP位点概率总和的公式为：






H1，H2∈{MI，MII，PI，PII}，
b1和b2是染色体发生重组的计算位置，当上述两个计算结果之一小于检测阈值时，染色体倍数异常为阳性，检测阈值见表3。


8.根据前述权利要求中任一项所述的用于胎儿无创产前筛查的检测方法，其特征在于，所述靶向捕获探针覆盖包含基因突变的全部基因；优选地，所述靶向捕获探针覆盖以下基因：FGFR3、FGFR2、PTPN11、RAF1、RIT1、SOS1、COL1A1、COL1A2、COL2A1、OTC和MECP2。


9.根据前述权利要求中任一项所述的用于胎儿无创产前筛查的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中使用的靶向捕获探针使用以下靶向捕获探针的设计方法获得，所述方法包括以下步骤：
(1)确定目标SNP位点；
(2)对于每一个靶向捕获的SNP位点，根据所述SNP位点设计四种探针，四种探针在所述SNP位点上分别被设计为-A-、-G-、-C-、-T-；
(3)对于每一个靶向捕获的SNP位点，分别计算出四种探针和两种靶标序列结合的退火温度(Tm)，所述两种靶标序列分别带有两种不同的单核苷酸多态性；并依此计算出所述四种探针和两种靶标序列结合的退火温度的差值(ΔTm)；根据计算结果，选择四种探针中ΔTm最低的探针，确定为该位点的最优探针。


10.根据权利要求9所述的用于胎儿无创产前筛查的检测方法，其特征在于，所述靶向捕获探针的设计方法中，所述两种靶标序列分别为作为野生型的参考基因序列和作为突变型的突变基因序列；其中，四种探针和作为野生型的参考基因序列结合的Tm值分别为：Tma、Tmg、Tmc、Tmt，四种探针和作为突变型的突变基因序列结合的Tm值分别为：Tma’、Tmg’、Tmc’、Tmt’，四种探针和两种靶标序列结合的Δ...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：北京博昊云天科技有限公司，博昊云天智造北京科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11