一株分泌抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用制造技术

本发明专利技术属于免疫学和和体外诊断技术领域，涉及一株分泌抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，杂交瘤细胞株命名为16F3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202113。该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体为抗新冠病毒N蛋白抗体。本发明专利技术所提供的杂交瘤细胞株16F3及其传代细胞株，能够稳定分泌抗新型冠状病毒N蛋白的单克隆抗体，分泌的抗体具有高效价、高亲和力、高特异性和高灵敏度；该抗体针对新型冠状病毒N蛋白，亚型为IgG1，亚型单一，抗体效价高；该抗体能够特异性结合新型冠状病毒2019

【技术实现步骤摘要】
一株分泌抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用


[0001]本专利技术属于免疫学和体外诊断
，涉及一株能分泌抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体和应用。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒会导致发热、咳嗽以及气促和呼吸困难等呼吸道症状，严重的可导致急性呼吸综合征，甚至死亡。目前对该病毒检测的主要方法是PCR技术，PCR检测的是mRNA水平，且检测用时比较长，需要2～3h；PCR检测对设备、环境和操作人员的要求比较高，检测效率比较低；PCR检测对样本的时效性有要求，样本采集后，需要在一定时间内完成检测，否则会影响检测结果；另外核酸检测的成本比较高。
[0003]抗体检测方法是从蛋白水平上进行检测，操作简单快捷，检测时间可缩短至10min左右，提高检测效率；但是，抗体检测是采集血清、全血或血浆进行检测，很容易受样本中其他抗体的干扰，产品灵敏度和准确率相对比较低，检测容易出现漏检和假阳；已经痊愈的患者和复阳患者体内均存在抗体，这种情况下，抗体检测方法无法对二者进行区分；一般抗体的产生需要1周左右的时间，抗体筛查虽然快速方便，但不适合做人群筛查和感染初期的发现。
[0004]抗原检测方法相比于抗体检测和核酸检测方法，同样可以使用咽拭子样本，可以在病毒感染早期进行筛查，且对场地和设备要求不高，可以随时随地进行检测，提高检测效率，做到尽早发现，尽早隔离。因此，制备高效价、高灵敏度和特异性的抗体并用于检测，具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一株分泌抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
[0006]本专利技术的技术方案是：
[0007]本专利技术提供了分泌抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株16F3，其保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址为中国武汉，武汉大学；保藏编号为CCTCC NO：C202113。
[0008]本专利技术还提供了该杂交瘤细胞株的制备方法，即用新型冠状病毒N蛋白的基因重组蛋白进行小鼠免疫，取免疫小鼠脾脏、胸腺和四肢的B淋巴细胞，和小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合，经过亚克隆和筛选得到杂交瘤细胞株，命名为16F3，该细胞株能够稳定分泌抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体。
[0009]本专利技术还提供了杂交瘤细胞株16F3分泌产生的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体。将杂交瘤细胞株16F3分泌的单克隆抗体命名为单克隆抗体16F3。
[0010]进一步的，所述单克隆抗体为IgG1亚型，对新型冠状病毒N蛋白有特异性。
[0011]本专利技术还保护所述单克隆抗体在检测新型冠状病毒N蛋白中的应用。
[0012]进一步的，所述单克隆抗体用于制备检测新型冠状病毒N蛋白的检测试剂。
[0013]本专利技术的有益效果：
[0014]本专利技术提供的杂交瘤细胞株16F3及其传代细胞株，能够稳定分泌抗新型冠状病毒N蛋白的单克隆抗体，分泌的抗体具有高效价、高亲和力、高特异性和高灵敏度；该抗体针对新型冠状病毒N蛋白，亚型为IgG1，亚型单一，抗体效价高；该抗体能够特异性结合新型冠状病毒2019
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nCoV的N蛋白，特异性好。
[0015]生物材料保藏信息如下：
[0016]本专利技术的杂交瘤细胞株16F3，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏单位地址为中国湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，武汉大学保藏中心；保藏编号为CCTCC NO：C202113；保藏时间为2020年12月30日。
附图说明
[0017]图1为抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体效价和亲和力的检测结果；
[0018]图2为杂交瘤细胞株16F3不同传代次数检测效价一致性结果；
[0019]图3为抗体的双抗体夹心法的检测结果；
[0020]图4为抗体的胶体金法的检测结果。
具体实施方式
[0021]为了进一步理解本专利技术，下面将结合实施例和附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0022]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的常规技术或按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0023]实施例1
[0024]可分泌抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备
[0025]1、小鼠免疫
[0026]用新型冠状病毒的重组N蛋白免疫6周龄的雌性balb/c小鼠。蛋白按照100μg/只的剂量与等体积的弗氏完全佐剂混合，乳化完全，背部皮下多点免疫小鼠。三周后加强免疫，蛋白按照50μg/只的剂量与等体积的不完全弗氏佐剂混合，乳化完全，背部皮下多点免疫小鼠。1周后，对小鼠进行断尾采血，检测血清效价。血清效价达到5万以上，准备融合。融合前3天，对小鼠进行腹腔注射免疫，不加佐剂，免疫剂量为100μg/只。
[0027]2、细胞融合
[0028]在进行杂交瘤制备过程中，通过调整胎牛血清的品质，选取质量好、批间稳定的胎牛血清，优化胎牛血清浓度，选择优质骨髓瘤细胞和小鼠免疫淋巴细胞，增强细胞融合效率。
[0029]融合时，在无菌环境下，取免疫小鼠的脾脏、胸腺和四肢淋巴结，研磨分散细胞，用
红细胞裂解液裂解红细胞，离心后收集小鼠B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞sp2/0按照5～10:1的比例进行混合，离心，用无血清DMEM培养基清洗细胞，确保混合细胞中无胎牛血清，在37℃水浴中，用0.8ml PEG进行细胞融合，在1min内边滴加PEG，边轻柔混合，静置30s，使PEG充分作用。
[0030]融合结束后，用20ml无血清DMEM终止融合，加入速度由慢到快，在10min内加完。终止结束后，将细胞放入二氧化碳培养箱中孵育15min，800rpm/min离心10min，用HAT培养基重悬融合细胞，置于96孔细胞培养板中，放入二氧化碳培养箱进行培养。
[0031]3、杂交瘤细胞筛选和亚克隆
[0032]融合后第五天用HAT培养基全换液，第七天通过间接ELISA的方法检测培养上清。具体检测方法如下：
[0033](1)包被：用CBS缓冲液将新型冠状病毒的重组N蛋白稀释成0.5μg/ml，100μg/孔包被到酶标板中，4℃包被过夜。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
[0034](2)封闭：用含2％甘氨酸的PBST缓冲液封闭酶标板，200μg/孔，37℃孵育2h。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
[0035](3)检测：将待检测的细胞上清加入到酶标板中，100μg/孔，同时用小鼠免疫血清做阳性对照，用HAT培养基做空白对照，37℃孵育1h。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株分泌抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株16F3，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202113。2.一种抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株16F3分泌产生...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨帆，刘万建，杨致亭，刘洋，李文，吴姝青，王婷，田永帅，
申请(专利权)人：青岛硕景生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：