【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及体外诊断和基因工程，特别涉及一种产量高、稳定性好的重组肌酐酶及其制备方法和应用。
技术介绍
1、肌酐是人体肌肉中的磷酸肌酸通过自发的且不可逆转的过程形成的，在肾脏功能正常情况下，肌酐在血液中的浓度维持在一个较低的水平，而肾脏功能不全时，会导致肌酐在血清中的积累，血清中肌酐含量是反映肾脏功能的重要指标。对于肌酐的检测，应用最为广泛的是碱性苦味酸法，但存在的着反应特异性差与灵敏度有限的问题，目前正逐渐被酶法(肌酐酶酶偶联肌氨酸氧化酶法)检测所替代，其中肌酐酶、肌酸酶和肌氨酸氧化酶是三个关键性的酶，肌酐酶可逆地水解肌酐生成肌酸，肌酸酶催化肌酸水解产生肌氨酸和尿素，肌氨酸在肌氨酸氧化酶作用下水解生成甲醛、甘氨酸和h2o2，偶联trinder氏反应，通过比色测定，计算出样品中肌酐的含量。酶法具有抗干扰能力强、特异性好、线性范围宽、灵敏度高等特点，商品化的试剂盒大多采用肌酐酶偶联肌氨酸氧化酶法，在临床上得到了越来越多的使用。
2、作为酶法检测肌酐的关键酶，肌酐酶(creatininase，crn)催化肌酐水解为肌酸的可逆反应。在自然环境中，恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)、产脲节杆菌(arthrobacter ureafaciens)、烟草节杆菌(arthrobacter nicotianae)等微生物均可产生一定的肌酐酶。但野生菌株存在着肌酐酶产量低、工业化放大困难的问题，这很大程度上导致肌酐酶生产成本过高，如何进一步实现肌酐酶的高效表达对于促进其在肌酐酶法检测中的应用尤为重要。
4、因此，现有技术有待进一步改进。
技术实现思路
1、针对上述问题，本专利技术提供了一种产量高、稳定性好的重组肌酐酶及其制备方法和应用，所述重组肌酐酶在肌酐酶氨基酸n端添加一段多肽，该多肽片段有助于提高肌酐酶在大肠杆菌中的表达量，同时也有助于提高重组肌酐酶的热稳定性，本专利技术所得的重组肌酐酶具有产量高、纯度高、酶活高、热稳定性好的特点，能够克服现有技术中表达的肌酐酶比酶活不高，且存在纯化方法复杂、酶蛋白回收率低等问题。另外本专利技术的重组肌酐酶可借助现有的原核表达体系或真核表达体系进行工业化生产，极大提高其生产效率、批间差及产量。
2、具体的，本申请提供的技术方案如下：
3、第一方面，本申请提供一种重组肌酐酶，其氨基酸序列如seq id no:1所示，优选的，该序列中包含多肽片段，其氨基酸序列如seq id no:2所示。
4、第二方面，本申请还提供一种上述的重组肌酐酶的编码基因，其核苷酸序列如seqid no:3所示。该序列是基于大肠杆菌表达体系进行密码子优化后的序列，不含有大肠杆菌的稀有密码子，适合在大肠杆菌表达系统中进行表达。
5、其他情况下，为了将上述氨基酸序列如seq id no:1所示的重组肌酐酶在其他原核或真核体系中进行表达，可基于本领域常规技术手段对其基因序列进行对应的优化，从而得到对应的编码序列。
6、因此，本申请保护的重组肌酐酶不限于编码基因序列如seq id no:3所示的序列。
7、第三方面，本申请还提供一种重组表达载体，由表达载体和前述的重组肌酐酶的编码基因添加酶切位点重组而成。
8、优选地，所述表达载体为pet系列表达载体，如pet-32a质粒、pet-28a或者pet-41a等。
9、进一步的，以第二方面所述的核苷酸序列seq id no:3为模板，以seq id no:4，seq id no:5为引物，在n，c末端引入nco i，xho i酶切位点，通过酶切连接将目的基因连接到原核表达载体pet28a中，制备得到重组表达载体pet28a-rcrn。
10、其他情况下，基于本领域常规技术手段对其基因序列进行对应的优化，从而得到对应的编码序列，表达载体可采用适合转化其他原核或真核表达系统的表达载体。
11、第四方面，本申请还提供一种重组工程菌株，是向宿主菌种转化如第三方面所述的重组表达载体制备而成。
12、优选地，所述宿主菌为大肠杆菌，如大肠杆菌bl21(de3)、大肠杆菌rosseta或者其他大肠杆菌突变表达菌株等。
13、其他情况下，基于本领域常规技术手段对其基因序列进行对应的优化，从而得到对应的编码序列，表达载体采用适合转化其他原核或真核表达系统的表达载体，宿主菌可采用与其匹配的大肠杆菌rosseta或者其他大肠杆菌突变表达菌株，毕赤酵母等。
14、第五方面，本申请还提供一种前述的重组肌酐酶的制备方法，包括以下步骤：以合成基因seq id no.3为模板，以seq id no.4、seq id no.5为引物扩增所述核苷酸序列，
15、s1:将扩增的核苷酸序列连接到质粒载体pet28a中，形成重组质粒；
16、s2:将步骤1中的重组质粒转化入大肠杆菌感受态细胞，进行重组蛋白表达；
17、s3:通过添加iptg诱导重组蛋白表达；
18、s4:通过高温孵育除杂、ni离子亲和层析等方法分离纯化重组蛋白。
19、第六方面，本申请还提供一种肌酐酶检测试剂盒，所述试剂盒中所用肌酐酶为权利要求1所述的重组肌酐酶。
20、进一步的，所述肌酐酶试剂盒由试剂r1和试剂r2两部分组成：
21、试剂r1:三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐(tris-hcl)20-50mmol/l
22、n-乙基-n-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺0.4-1mmol/l
23、肌酸酶5-10ku/l
24、肌氨酸氧化酶2-4ku/l
25、抗坏血酸氧化酶0.5-1ku/l
26、试剂r2:三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐(tris-hcl)20-50mmol/l
27、4-氨基安替比林2-5mmol/l
28、肌酐酶100-150ku/l
29、过氧化物酶2-5ku/l
30、优选的最佳配方：所述肌酐酶试剂盒由试剂r1和试剂r2两部分组成：
31、试剂r1:三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐(tris-hcl)20mmol/l
32、n-乙基-n-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺0.4mmol/l
33、肌酸酶5ku/l
34、肌氨酸氧化酶2ku/l
35、抗坏血酸氧化酶0.5ku/l
36、试剂r2:三羟甲基氨基甲烷-盐酸盐(tris-hcl)20mmol/l
37、4-氨基安替比林2mmol/l
38、重组肌酐酶100ku/l<本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组肌酐酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.如权利要求1所述的一种重组肌酐酶，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于，由表达载体和如权利要求2所述的重组肌酐酶的编码基因添加酶切位点重组而成。
4.一种重组工程菌株，其特征在于，是向宿主菌种转化如权利要求3所述的重组表达载体制备而成。
5.一种如权利要求1所述的重组肌酐酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以SEQID NO:3为模板，以SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5为引物扩增所述核苷酸序列，
6.一种肌酐酶检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中所用肌酐酶为权利要求1所述的重组肌酐酶。
7.根据权利要求6所述的一种肌酐酶检测试剂盒，其特征在于，所述肌酐酶试剂盒由试剂R1和试剂R2两部分组成：
【技术特征摘要】
1.一种重组肌酐酶，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no:1所示。
2.如权利要求1所述的一种重组肌酐酶，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no:3所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于，由表达载体和如权利要求2所述的重组肌酐酶的编码基因添加酶切位点重组而成。
4.一种重组工程菌株，其特征在于，是向宿主菌种转化如权利要求3所述的重组表达载体制备而成。
【专利技术属性】
技术研发人员：杨帆，李林，李文，吴姝青，邵建华，田永帅，刘万建，
申请(专利权)人：青岛硕景生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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