猴痘病毒重组抗原及其应用制造技术

本发明专利技术属于免疫检测技术领域，为了实现猴痘病毒血清学诊断，本发明专利技术提供猴痘病毒重组抗原A29、猴痘病毒重组抗原B21R及嵌合形式重组抗原A29

【技术实现步骤摘要】
猴痘病毒重组抗原及其应用


[0001]本专利技术属于免疫检测
，具体涉及猴痘病毒重组抗原及其应用。

技术介绍

[0002]猴痘是由猴痘病毒(monkeypox virus)感染引起的一种罕见、散发、天花样人兽共患传染疾病。猴痘病毒是痘病毒科正痘病毒(orthopox virus)属成员，在正痘病毒属中有多种能导致人类疾病的病毒，如天花病毒、猴痘病毒、牛痘病毒和痘苗病毒等。猴痘病毒毒力较强，但感染性和致病性均弱于天花病毒，病人症状与过去在天花病人身上所观察到的相似，但临床严重程度较轻。猴痘临床症状与天花相似，但病情相对天花较轻，病死率为1％～10％，主要表现为皮肤出现类似天花的水疱或脓疱，有发热、头痛、全身不适、浅表淋巴结肿大等前驱症状。早期出现的淋巴结肿大是猴痘区别于天花的一个特征。在当今，全球天花已被消灭三十多年，而猴痘病毒依然存在于自然界中，威胁着人类健康。世界卫生组织近日发布猴痘疫情暴发预警称，鉴于目前已在多个未流行猴痘病毒的国家发现病例，未来有可能在这些国家及其他国家发现更多病例，猴痘病毒将进一步传播。
[0003]目前国际上普遍采用的猴痘病毒感染确诊判断方法为美国CDC官网公布的临床症状加流行病学背景和实验室检测三者结合。实验室检测推荐的方法是PCR方法，该方法具有高度的灵敏性，然而这种方法严格依赖于感染期病毒的存在，同时也依赖于临床样品的正确采集、储存。这些都限制了单一PCR诊断的准确性，因此二种或多种方法的联合使用对于提供准确的实验室检测诊断是必要的。有研究发现正痘病毒的IgG抗体最早在出疹后2d就可检出，因此血清IgG抗体的检测窗口期可以从出疹几天到感染恢复后几十年。正痘病毒属成员，包括天花病毒、猴痘病毒、痘苗病毒、牛痘病毒，共有许多保守的表面抗原，导致在标准血清学分析，如ELISA、放射免疫分析、和荧光免疫分析中存在广泛交叉反应，因此选择猴痘病毒编码的几个在其他几种正痘病毒中不存在、截断或突变，对于开发具有特异性强的猴痘病毒血清学诊断方法具有重要意义，是亟需解决的问题。

技术实现思路

[0004]为了实现猴痘病毒血清学诊断，本专利技术提供了一种检测猴痘病毒抗体的重组抗原及编码该重组抗原的核酸序列，所述重组抗原能够可溶性表达，灵敏度高，特异性好；本专利技术还提供了所述重组抗原的制备方法；本专利技术还提供了所述重组抗原在金标层析检测平台的应用。
[0005]第一方面本专利技术提供了用于检测猴痘病毒的重组抗原A29，所述重组抗原A29具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。
[0006]第二方面本专利技术提供了用于检测猴痘病毒的重组抗原B21R，所述重组B21R抗原具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列，SEQ ID NO.3氨基酸序列是在SEQ ID NO.2基础上添加TRX标签及HIS标签的氨基酸序列。
[0007]第三方面本专利技术提供了用于检测猴痘病毒的嵌合形式重组抗原A29
‑
B21R，所述重
组抗原是将A29片段与B21R片段进行连接，具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。进一步的，再构建到pGEX
‑
4T
‑
1质粒上进行转化表达，N端带GST标签，加标签后的重组抗原A29
‑
B21R具有SEQ ID NO.5所示氨基酸序列。
[0008]第四方面本专利技术提供以上第一方面到第三方面所述重组抗原的核苷酸序列SEQ ID NO.6
‑
8。
[0009]第五方面本专利技术提供了扩增第三方面所述核苷酸序列所需引物序列SEQ ID NO.9
‑
12。
[0010]第六方面本专利技术提供了构建以上重组抗原的表达载体pGEX
‑
4T
‑
1以及该载体所转化的大肠杆菌BL21(Rosetta)菌种。
[0011]第七方面本专利技术还提供了上述重组抗原的制备方法，包括：
[0012](1)密码子优化后合成SEQ ID NO.6
‑
7核苷酸序列，并分别构建到pET28a、pET32a载体上，命名为pET28a
‑
A29，pET32a
‑
B21R；
[0013](2)以SEQ ID NO.6
‑
7为模板，以SEQ ID NO.9
‑
12为引物，采用嵌套PCR扩增SEQ ID NO.8所述核苷酸序列；
[0014](3)将扩增的SEQ ID NO.8核苷酸序列连接到载体pGEX
‑
4T
‑
1，形成重组质粒pGEX
‑
4T
‑1‑
A29
‑
B21R；
[0015](4)将步骤(1)和(3)中的重组质粒转化入大肠杆菌感受态细胞，进行重组抗原表达；
[0016](5)通过亲和层析等方法分离纯化出重组抗原。
[0017]第八方面本专利技术提供了猴痘病毒阳性质控品，以及其制备方法：以纯化后重组蛋白pET28a
‑
A29，及pET32a
‑
B21R分别为免疫原，对兔子进行免疫，免疫后所得兔多抗血清，经梯度稀释后作为猴痘病毒阳性质控品。
[0018]第九方面本专利技术提供了上述重组抗原制备的猴痘病毒抗体检测试纸条。
[0019]所述猴痘病毒检测试纸条，包括包被抗原，标记抗原，GST单克隆抗体以及标记物；所述标记抗原为SEQ ID NO.5所示的N端添加GST标签的猴痘重组抗原A29
‑
B21R；
[0020]所述包被抗原为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4中至少两种猴痘重组抗原的混合物；
[0021]所述标记物通过GST单克隆抗体与标记抗原间接结合。
[0022]有益效果：本专利技术提供的重组抗原能够可溶性表达，灵敏度高，特异性好；为猴痘病毒血清学诊断提供了基础。
附图说明
[0023]图1本专利技术A29
‑
B21R基因序列PCR流程图；
[0024]图2为本专利技术重组抗原A29、B21R、A29
‑
B21R聚丙烯酰胺凝胶电泳结果；
[0025]图3为本专利技术兔多抗ELISA效价检测结果；
[0026]图4为本专利技术制备的猴痘病毒质控品效价检测结果。
具体实施方式
[0027]下面结合具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。
[0028]实施例1：重组质粒构建
[0029](1)重组质粒构建
[0030]猴痘病毒(MPV)参考GenBank数据库NC_003310.1序列，通过密码子优化合成A29(1
‑
110aa)、B21R(1781
‑
1810aa
‑
linker(G3S)3‑
1841
‑
1870aa)(擎科生物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猴痘病毒重组抗原A29，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的猴痘病毒重组抗原A29，其特征在于，其基因序列为SEQ ID NO.6所示。3.一种猴痘重组抗原B21R，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。4.根据权利要求3所述的猴痘重组抗原B21R，其特征在于，其基因序列为SEQ ID NO.7所示，将所述猴痘重组抗原B21R的基因序列连接到pET32a载体上，N端添加trx标签，N端和C端分别添加6
×
His标签，加标签后的重组抗原B21R的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。5.一种猴痘病毒重组抗原A29
‑
B21R，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.4所示。6.根据权利要求5所述的猴痘病毒重组抗原A29
‑
B21R，其特征在于，其基因序列为SEQ ID NO.8所示，将其基因序列连接到pGEX
‑
4T
‑
1载体上，N端添加GST标签，加标签后的重组抗原A29
‑
B21R的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示。7.权利要求5所述的重组抗原A29
‑
B21R的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：以A29的基因序列为模板，P1为上游引物、P2为下游引物扩增A29基因片段，以B21R的基因序列为模板，以P3为上游引物、P4为下游引物扩增第二段目的基因序列；扩增产物经回收后，按1:1摩尔比混合，作为模板，再以P...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨帆，刘万建，李林，董丽宁，邵建华，宋金玲，刘爱骅，
申请(专利权)人：青岛硕景生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：