本发明专利技术涉及医药技术领域，具体涉及一种结节性皮肤病病毒单克隆抗体及其应用。本发明专利技术提供一种具有免疫原性的蛋白rLP32Δ，所述rLP32Δ的编码序列如SEQ ID No.1的第4～717位所示；所述的蛋白rLP32Δ的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第2～239位所示。本发明专利技术利用灭活的山羊痘病毒作为免疫原进免疫小鼠，并通过原核系统获得了LSDV免疫原性较强的P32蛋白的截断蛋白rLP32Δ，利用rLP32Δ用进行LSDV单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选以及后续ELISA检测方法的建立，从而在最大程度上保持病毒抗原天然构象的同时，极大地避免了不必要的生物安全隐患。极大地避免了不必要的生物安全隐患。极大地避免了不必要的生物安全隐患。
【技术实现步骤摘要】
一种结节性皮肤病病毒单克隆抗体及其应用
[0001]本专利技术涉及医药
，具体涉及一种结节性皮肤病病毒单克隆抗体及其应用。
技术介绍
[0002]结节性皮肤病(LSD)是一种由结节性皮肤病病毒(Lumpy Skin Disease Virus， LSDV)引起的外来疾病，能够引起幼牛产生较高的死亡率(40～75％)及奶牛的产奶量下降、流产、肉牛产量下降等临床症状，从而造成了严重的经济损失。 LSD最早报道于1929年的撒哈拉以南的非洲地区，之后LSD的感染急剧蔓延，首先传播到非洲大部分地区，然后通过中东，并进一步传播到欧洲和欧亚大陆的亚洲部分。自2016年以来，在西南亚和东欧的许多国家，如土耳其、希腊、保加利亚、北马其顿共和国、塞尔维亚，都出现了LSD疫情，其次是东亚的几个新国家，包括中国，孟加拉和印度。
[0003]LSD目前没有特效治疗药物，且我国没有商品化的结节性皮肤病的专用疫苗。结节性皮肤病病毒(LSDV)外来病毒，属于二类动物疫病，一类管理。即对该病毒的研究需要特定的实验室条件，这造成了对该病毒研究的障碍。
[0004]已有的研究表明，LSDV与羊痘病毒(SPPV)和山羊痘病毒(GTPV)同属于痘病毒科、羊痘病毒属(CapPVs)。LSDV是一种相对较大的双链DNA包膜病毒，基因组约为151kbp，包含156个预测基因，与其他两种羊痘病毒属的SPPV 和GTPV的基因组具有97％的同源性，导致LSDV与山羊痘具有交叉保护作用。
[0005]为此，我国目前疫苗的研究方向主要采用山羊痘病毒灭活疫苗来预防牛的结节性皮肤病。然而，由于LSD对于我国来说属于新型外来病，我国目前将该病按照二类动物疫病进行防控，感染牛按照要求应进行扑杀，无害化处理，且目前缺少有效的LSDV抗体检测试剂盒，导致相关疫苗研制过程中LSDV抗体阴性动物筛选较为困难，且靶动物的免疫效果评价只能采取涉及到具有活性的 LSDV的免疫攻毒法，存在较大的生物安全隐患。为此，急切需要建立快速、灵敏、特异的LSDV抗体ELISA检测方法。
[0006]现有技术中已经公开了结节性皮肤病病毒LSDV的P32蛋白及其抗原性，但获得的P32蛋白疏水性较强，影响了其生物学应用。现有技术获取的P32蛋白多以包涵体的形式存在，可溶性的蛋白量较少，而且对表达产物的处理过程复杂，表达量也偏低。
技术实现思路
[0007]本专利技术的目的在于提供一种重组的LSDV的P32蛋白可溶性截断蛋白 rLP32Δ，并提供一种分泌抗LSDV的杂交瘤细胞株，并利用该杂交瘤细胞株制备单克隆抗体，进一步建立LSDV的阻断ELISA检测方法，从而为LSDV疫苗的研发以及效力检验替代方法的研制提供技术支持。
[0008]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下。
[0009]第一方面，本专利技术提供一种具有免疫原性的蛋白rLP32Δ，所述rLP32Δ的编码序
列如SEQ ID No.1的第4～717位所示。
[0010]在一个具体实施例中，所述的编码序列是所按照大肠杆菌偏爱密码子对 LSDV的P32蛋白的1～238位氨基酸编码序列进行优化，并在C末端引入6
×
His 标签而合成基因片段GLP32Δ。
[0011]进一步的，所述的蛋白rLP32Δ的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第2～239位所示。
[0012]在一个具体实施例中，其是由重组表达rLP32Δ的宿主细胞大肠杆菌的BL21 (DE3)细胞株作为生产菌株制备的；
[0013]所述的菌株为大肠埃希氏菌BL/321株，保藏号为CGMCC No.24528。
[0014]进一步的，所述的蛋白rLP32Δ为可溶性蛋白。
[0015]在一个具体实施例中，可溶性rLP32Δ蛋白是用生产菌株大肠埃希氏菌 BL/321株经发酵培养、诱导表达、菌体破碎、可溶性抗原蛋白分离纯化后获得。
[0016]第二方面，本专利技术提供一种分泌抗LSDV的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0017]一种分泌抗LSDV的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述的杂交瘤细胞株为 LSDV杂交瘤细胞CP4E2；
[0018]其的保藏号为CGMCC No.45131。
[0019]在一个具体的实施例中，所述的杂交瘤细胞株由以下方法制备获得：
[0020]S101山羊痘病毒作为抗原免疫动物，免疫后动物的脾细胞与SP2/0细胞融合；
[0021]S102融合细胞利重组蛋白rLP32Δ进行阳性克隆与亚克隆的筛选，能够稳定分泌抗LSDV单抗的杂交瘤细胞株为LSDV杂交瘤细胞CP4E2。
[0022]第三方面，本专利技术提供一种LSDV的单克隆抗体。
[0023]一种LSDV的单克隆抗体，所述的单克隆抗体由LSDV杂交瘤细胞CP4E2 分泌：
[0024]所述的单克隆抗体为单克隆抗体4E2。
[0025]在一个具体的实施例中，所述的单克隆抗体4E2从LSDV杂交瘤细胞CP4E2 的培养液中获得或用杂交瘤细胞株接种到小鼠腹腔产生腹水而获得。
[0026]在一个具体的实施例中，所述的单克隆抗体4E2用杂交瘤细胞株CP4E2接种到小鼠腹腔产生腹水而获得。
[0027]第四方面，本专利技术提供一种抗LSDV多克隆抗体的制备方法。
[0028]一种抗LSDV多克隆抗体的制备方法，所述的制备方法为：用LSDV腹部皮下多点注射牛，攻毒后14天，采集发病牛的血清，从血清中分离得到LSDV 多克隆抗体。
[0029]第五方面，本专利技术提供一种LSDV的单克隆抗体的用途。
[0030]一种LSDV的单克隆抗体的用途，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；
[0031]所述试剂、检测板或试剂盒用于检测样品中LSDV；
[0032]所述药剂用于LSDV的抗体阴性动物的筛选和/或疫苗效力检验。
[0033]单克隆抗体的制备是建立优良ELISA检测方法的基础，而免疫原是单克隆抗体制备的关键。为此，本专利技术利用灭活的山羊痘病毒作为免疫原进免疫小鼠，并通过原核系统获得了LSDV免疫原性较强的P32蛋白的截断蛋白rLP32Δ，利用rLP32Δ用进行LSDV单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选以及后续ELISA检测方法的建立，从而在最大程度上保持病毒抗原天然构象的同时，极大地避免了不必要的生物安全隐患。
[0034]同时，本专利技术利用筛选获得的单克隆抗体建立LSDV抗体的阻断ELISA检测方法，从
而为LSDV相关疫苗的研究以及效力检验替代方法的研制提供了技术支持。
[0035]本专利技术首次通过大肠杆菌表达系统获得以可溶性形式表达的LSDV截短的重组P32蛋白rLP32Δ，并首次利用该蛋白作为包被抗原、灭活的山羊痘病毒作为免疫抗原进行抗单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选和LSDV抗体阻断ELISA的建立。本专利技术技术方案具有以下优点：
[0036](1)首次通过密码子优化和人工合成技术，通过大肠杆菌表本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种具有免疫原性的蛋白rLP32Δ，其特征在于：所述rLP32Δ的编码序列如SEQ ID No.1的第4～717位所示；其是所按照大肠杆菌偏爱密码子对LSDV的P32蛋白的1～238位氨基酸编码序列进行优化，并在C末端引入6
×
His标签，合成基因片段GLP32Δ。2.根据权利要求1所述的一种具有免疫原性的蛋白rLP32Δ，其特征在于：所述的蛋白rLP32Δ的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第2～239位所示；其是由重组表达rLP32Δ的宿主细胞大肠杆菌的BL21(DE3)细胞株作为生产菌株制备的；所述的菌株为大肠埃希氏菌BL/321株，保藏号为CGMCC No.24528。3.根据权利要求1所述的一种具有免疫原性的蛋白rLP32Δ，其特征在于，所述的蛋白rLP32Δ为可溶性蛋白；其是用生产菌株大肠埃希氏菌BL/321株经发酵培养、诱导表达、菌体破碎、可溶性抗原蛋白分离纯化后获得。4.一种分泌抗LSDV的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，所述的杂交瘤细胞株为LSDV杂交瘤细胞CP4E2；其的保藏号为CGMCC No.45131。5....
【专利技术属性】
技术研发人员：杜吉革，陈小云，印春生，朱真，张广川，李正武，李启红，王利永，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：
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