【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因重组和生化酶法诊断，特别涉及一种热稳定性好的重组甘油激酶及其制备方法和应用。
技术介绍
1、甘油三酯(tg)又称为中性脂肪，是甘油分子与脂肪酸反应所形成的脂类，为血脂的其中一种组成部分，具有为细胞代谢提供能量的功能。甘油三酯测定为血脂检查中的一项重要内容，是血浆中各脂蛋白所含甘油三酯的总和。
2、测定甘油三酯的重要意义在于诊断和处理高脂血症。这些疾病既可能是原发性的，也可能继发于其他疾病，如：肾病、糖尿病和内分泌失调。甘油三酯升高已被证实是冠状动脉硬化性心脏病的危险因素。常见的检测方法有：酶法、电化学法和干化学法等。因为化学法测定存在诸多缺点，所以现在已陆续被酶法所取代。酶法快速准确，操作简单，并能在自动生化分析仪上进行大批量标本检测。酶法检测甘油三酯的反应原理为：采用脂蛋白酯酶、甘油激酶、甘油磷酸氧化酶偶联trinder反应。脂蛋白酯酶先催化甘油三酯的水解产生甘油和脂肪酸，随后，甘油激酶催化甘油的磷酸化，产生甘油-3-磷酸。甘油-3-磷酸在甘油磷酸氧化酶催化下被氧化为磷酸二羟丙酮和过氧化氢，后者与4-氨基安替比林(4-aap)和3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠(dhbs)经过氧化物酶的作用(trinder反应)形成红色的醌亚胺化合物，从而引起520nm处吸光度的上升，此种变化与样品中的甘油三酯浓度成正比。
3、甘油激酶(glycerol kinase，gk)(e.c 2.7.1.30)属于氧化还原酶，主要存在于能够利用甘油作为碳源的微生物中，如大肠杆菌、芽胞杆菌、柠檬菌属等。甘油激酶催化
4、国外已有将甘油激酶基因的克隆表达并商品化的报道，而国内有关甘油激酶基因克隆高效表达的报道却很少，基因工程技术的发展使得诊断用工具酶的大量制备相对比较容易，但这些蛋白类产品存在许多问题，例如热稳定性差、易被蛋白水解酶降解、溶解性差等。因此这些基因工程产品必须进行优化，提高热稳定性、改善各项性能，才能使其更好的被使用。
5、因此，现有技术有待进一步改进。
技术实现思路
1、针对上述问题，本专利技术提供了一种热稳定性好的重组甘油激酶及其制备方法和应用，通过易错pcr方式，将其序列进行随机突变，通过基因重组技术构建至大肠杆菌菌株，通过高通量筛选方式成功获得一株热稳定好的甘油激酶菌株，并通过发酵纯化技术获得该酶，并将该热稳定性好的甘油激酶成功运用到甘油三酯检测试剂盒中。
2、所述一种热稳定好的重组甘油激酶，以大肠杆菌菌种基因序列为模板，应用易错pcr技术进行随机突变，获得系列突变基因，构建gk的突变文库，转化至e.coli rosetta(de3)中，对平板上生长突变株进行热处理后高通量酶活筛选，将筛选出的热稳定性好的5-8株突变株再经摇瓶放大发酵纯化复筛，最终确定一株热稳定性好的gk重组表达菌株。该甘油激酶通过ni柱纯化，纯度高，避免了在应用过程中其他杂蛋白的干扰。该酶经60℃热处理30min，酶活力仍维持在53.5％，37℃热处理7d，酶活力仍维持在96.3％。该酶应用到甘油三酯检测试剂盒中，投料量少，进行37℃7d热处理，检测线性、精密度等各项指标，偏差均在5％以内。符合甘油三酯检测试剂盒对工具酶的要求。
3、具体的，本申请提供的技术方案如下：
4、第一方面，本申请提供一种重组甘油激酶，其氨基酸序列如seq id no:2所示。
5、与原有氨基酸序列相比，有8处氨基酸序列发生了改变，分别是31位v→a，82位n→i，187位a→g，237位r→s，309位m→i，326位d→e，456位q→l。
6、第二方面，本申请还提供一种上述的重组甘油激酶的编码基因，其核苷酸序列如seq id no:1所示。
7、与原有基因序列相比，有9处核苷酸序列发生改变，分别是92位g→c，245位a→t，442位c→t，560位c→g，709位c→a，888位t→a，927位g→c，978位c→g，1367位a→t。
8、第三方面，本申请还提供一种重组表达载体，由表达载体和上述的重组甘油激酶的编码基因重组而成。
9、优选地，所述表达载体为pet系列表达载体，如pet-32a质粒、pet-28a或者pet-41a等。
10、其他情况下，基于本领域常规技术手段对其基因序列进行对应的优化，从而得到对应的编码序列，表达载体可采用适合转化其他原核或真核表达系统的表达载体。
11、第四方面，本申请还提供一种重组工程菌，是向宿主菌种转化上述的重组表达载体制备而成。
12、优选地，所述宿主菌为大肠杆菌，如大肠杆菌bl21(de3)、大肠杆菌rosseta或者其他大肠杆菌突变表达菌株等。
13、其他情况下，基于本领域常规技术手段对其基因序列进行对应的优化，从而得到对应的编码序列，表达载体采用适合转化其他原核或真核表达系统的表达载体，宿主菌可采用与其匹配的大肠杆菌rosseta或者其他大肠杆菌突变表达菌株，毕赤酵母等。
14、第五方面，本申请还提供一种前述的重组甘油激酶的制备方法，包括以下步骤：
15、s1:参考genbank nc_000913.3中基因序列，以e.coli菌株k12为模板，进行易错pcr扩增突变，获得一些列突变基因，建立gk随机突变文库。；
16、s2：将s1所得突变文库连接到pet28a载体上，转化至大肠杆菌感受态细胞，将突变文库进行重组表达；
17、s3：对s2所得重组表达的菌株进行热处理，通过显色反应、高通量筛选，获得5-8株热稳定性好的甘油激酶；
18、s4：将s3筛选出的热稳定性好的多个突变株再经摇瓶放大发酵纯化复筛，得到热稳定性好的甘油激酶重组表达菌株；
19、s5：通过ni柱纯化得到该重组甘油激酶。
20、进一步的，更为具体的步骤如下：
21、大肠杆菌中含有甘油激酶的基因序列。本专利技术参考genbank nc_000913.3中基因序列，以e.coli菌株k12为模板，设计引物扩增:
22、上游引物:5’-catgccatgggtatgactgaaaaaaaatatatcgtt-3’(下划线处为nco i酶切位点)
23、下游引物：5’-ccctcgagttcgtcgtgttcttcccacgcca-3’(下划线处为xho i酶切位点)
24、经易错pcr扩增突变，所得片段为含有随机突变的gk基因序列，回收突变片段，用nco i和xhoi酶切，用t4连接酶连接到含有t7启动子的pet28a中，转化到e.coli表达菌株rosetta(de3)中，涂布于含有100μg/ml本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组甘油激酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种如权利要求1所述的重组甘油激酶的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于，由表达载体和如权利要求2所述的重组甘油激酶的编码基因重组而成。
4.一种重组工程菌，其特征在于，是向宿主菌种转化如权利要求3所述的重组表达载体制备而成。
5.一种如权利要求1所述的重组甘油激酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.如权利要求1所述的重组甘油激酶在检测试剂盒中的应用。
7.一种甘油三酯检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中所用甘油激酶为权利要求1所述的重组甘油激酶。
8.根据权利要求7所述的一种甘油三酯检测试剂盒，其特征在于，所述甘油三酯检测试剂盒由试剂R1和试剂R2两部分组成：
【技术特征摘要】
1.一种重组甘油激酶，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no:2所示。
2.一种如权利要求1所述的重组甘油激酶的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no:1所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于，由表达载体和如权利要求2所述的重组甘油激酶的编码基因重组而成。
4.一种重组工程菌，其特征在于，是向宿主菌种转化如权利要求3所述的重组表达载体制备而...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘万建，李林，王婷，董丽宁，杨帆，宋金玲，曾景斌，
申请(专利权)人：青岛硕景生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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