【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学，具体涉及一种用于检测ldl异常个体中pim1基因表达的引物，方法和试剂盒。
技术介绍
1、pim-1基因是一种位于6p21号染色体的原癌基因，包含6个外显子，编码丝氨酸/苏氨酸激酶，作为pim家族的一员，主要存在于造血细胞中。pim家族有三个成员pim-1、pim-2和pim-3，它们组成活性丝氨酸/苏氨酸激酶，在促进细胞存活、增殖和迁移中发挥重要作用。pim-1调节自身的表达和发挥功能，主要通过如jak/stat和pi3k/akt等的信号通路。
2、pim1的表达升高增加了细胞的有丝分裂活动。同时pim1还能与c-myc协同增强c-myb转录活动。pim1还可以保护由于各种应激而引起的细胞凋亡。pim1rna和蛋白的表达通常由许多细胞因子诱导产生，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、粒细胞集落刺激因素(g-csf)、白细胞介素3(il-3)、il-6和γ干扰素(ifn-γ)等。表明pim1可能介导信号转导部分通过这些因子的受体发挥作用。
3、ldl即为低密度脂蛋白，是血脂分类中的一项，且与多种心血管疾病有明显关联性。低密度脂蛋白数值低时对心血管具有一定保护作用，相反如果数值较高，则可能表明存在严重的高脂血症，表现为血脂调节异常，可能对血管壁的弹性或血管壁的肌层、内膜等造成损伤。低密度脂蛋白长期处于升高状态，则可能引起血管壁粥样硬化，影响血管的弹性，甚至导致高血压、冠心病等心血管疾病。
4、在各种白血病和实体瘤中都发现了pim1基因的过表达，并且也开始研究
5、实时荧光定量pcr技术是目前公认的最准确，重复性最好的定量pcr研究方法。其通过对pcr扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时监测从而实现对起始模板定量及定性的分析，优点如下：l)特异性强，灵敏度高；2)封闭反应，无需pcr后处理；3)定量范围宽，可达到l0个数量级；4)采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确；5)仪器在线式实时检测，结果直观，避免人为判断；6)可实现一管双检或多检；7)操作安全，缩短时间，提高效率。因此，荧光定量pcr技术已成功用于基因表达量检测的研究。荧光定量pcr技术常见的方法有sybr greeni染料法,双探针杂交法以及taqman技术等。其中sybr greeni由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。因此本研究采用实时荧光pcr技术结合mgb探针法应用于pim1基因表达量检测。
技术实现思路
1、本专利技术设计了特异性好，灵敏度高的检测pim1基因和内参gapdh基因表达的引物及探针序列，用荧光定量pcr技术检测pim1基因表达水平。通过调整两个基因引物和探针浓度及比例，优化pcr反应体系和反应条件，开发一种pim1基因表达水平的检测方法，以健康供者pim1基因表达量为参照，用于低密度脂蛋白异常的辅助诊断及心血管疾病的监测。
2、本专利技术提供了一种用于检测ldl异常的引物和探针，上游引物和下游引物设计在pim1基因的外显子4和外显子5上；探针设计在pim1基因跨e4和e5的区域上。
3、进一步的，所述引物和探针包括：检测pim1基因的上游引物pim1-f、pim1-r和探针pim1-probe，分别是：
4、pim1-f：tgctcaaggacaccgtctacac
5、pim1-r：atccactctggagggctatacact
6、pim1-mgb-probe：fam-acttcgatgggaccc–nfq-mgb。
7、所述引物和探针还包括内参基因gapdh的上游引物、下游引物和探针，
8、g-f：cctgcaccaccaactgcttag
9、g-r：cagtcttctgggtggcagtga
10、g–probe：cy5-catccatgacaactttggtatcgtg-bhq。
11、本专利技术提供了一种检测ldl异常的方法，包括以下步骤：
12、(1)提取edta抗凝全血标本中的总rna；
13、(2)将总rna逆转录成cdna；
14、(3)利用pim1基因的上下游引物和探针，以及gapdh基因的上下游引物及探针对步骤(2)中的cdna在一管中进行扩增；
15、(4)根据pim1基因的荧光信号和gapdh内参基因的荧光信号，获得样本中的pim1基因的相对表达量；
16、(5)若pim1基因表达量大于预设值，则判断ldl异常。
17、进一步的，检测pim1的上游引物和下游引物设计在pim1基因的外显子4和外显子5上；探针设计在pim1基因跨e4和e5的区域上。具体的为：
18、pim1-f：tgctcaaggacaccgtctacac
19、pim1-r：atccactctggagggctatacact
20、pim1-mgb-probe：fam-acttcgatgggaccc–nfq-mgb。
21、还进一步包括内参基因gapdh的上游引物、下游引物和探针分别是：
22、g-f：cctgcaccaccaactgcttag
23、g-r：cagtcttctgggtggcagtga
24、g–probe：cy5-catccatgacaactttggtatcgtg–bhq。
25、本专利技术还提供了一种检测ldl是否异常的试剂盒，所述试剂盒包括检测pim1基因相对表达量的引物和探针。
26、进一步的，检测pim1的上游引物和下游引物设计在pim1基因的外显子4和外显子5上；探针设计在pim1基因跨e4和e5的区域上。具体为：
27、pim1-f：tgctcaaggacaccgtctacac
28、pim1-r：atccactctggagggctatacact
29、pim1-mgb-probe：fam-acttcgatgggaccc–nfq-mgb。
30、还包括内参基因gapdh的上游引物、下游引物和探针分别是：
31、g-f：cctgcaccaccaactgcttag
32、g-r：cagtcttctgggtggcagtga
33、g–probe：cy5-catccatgacaactttggtatcgtg–bhq。
34、本专利技术提供了一种用于检测pim1基因相对表达量的引物和探针，所述引物和探针包括：
35、(1)检测pim1基因的上下游引物pi本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于检测LDL异常的引物和探针，其特征在于，上游引物和下游引物设计在PIM1基因的外显子4和外显子5上；探针设计在PIM1基因跨E4和E5的区域上。
2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括：
3.根据权利要求2所述的引物和探针，其特征在于，还包括内参基因GAPDH的上游引物、下游引物和探针，
4.一种检测LDL异常的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，检测PIM1的上游引物和下游引物设计在PIM1基因的外显子4和外显子5上；探针设计在PIM1基因跨E4和E5的区域上。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述引物和探针包括：
7.根据权利要求4所述的引物和探针，其特征在于，内参基因GAPDH的上游引物、下游引物和探针分别是：
8.检测LDL是否异常的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测PIM1基因相对表达量的引物和探针。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，检测PIM1的上游引物和下游引物设
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述引物和探针包括：
...【技术特征摘要】
1.用于检测ldl异常的引物和探针，其特征在于，上游引物和下游引物设计在pim1基因的外显子4和外显子5上；探针设计在pim1基因跨e4和e5的区域上。
2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括：
3.根据权利要求2所述的引物和探针，其特征在于，还包括内参基因gapdh的上游引物、下游引物和探针，
4.一种检测ldl异常的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，检测pim1的上游引物和下游引物设计在pim1基因的外显子4和外显子5上；探针设计在pim1基因跨...
【专利技术属性】
技术研发人员：王淑一，袁势超，张静，
申请(专利权)人：福州艾迪康医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：
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