一株分泌抗仲丁灵单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株分泌抗仲丁灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明专利技术分泌抗仲丁灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株1G5，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，分类命名为单克隆细胞株BZD，保藏日期2021年12月16日，保藏编号CGMCC No.45018。将仲丁灵的完全抗原免疫BALB/c小鼠，将高效价、低IC

【技术实现步骤摘要】
No.45018的杂交瘤细胞株BZD分泌产生。
[0009]本专利技术的第三个目的是，提供一种仲丁灵半抗原，用于制备上述的杂交瘤细胞株，结构简式如下式(I)：
[0010][0011]本专利技术的第四个目的是，提供一种仲丁灵半抗原的合成方法，包括以下步骤：
[0012]S1.将6
‑
氨基己酸溶于无水甲醇，冰浴下加入SOCl2，反应后旋干，得产物a即氨基酸甲酯盐酸盐；
[0013]S2.将2
‑
羟基
‑5‑
叔丁基
‑
1，3
‑
二硝基苯溶于甲苯，加入DMF和SOCl2混合回流8h反应后冷却，旋干，残留液过滤、洗涤，得产物b即2
‑
氯
‑5‑
叔丁基
‑
1，3
‑
二硝基苯；
[0014]S3.产物a用水溶解，浓氨水调节PH＝8.5，加入氯仿萃取，有机相旋干得到无色或淡黄色液体，再与添加有产物b及(iPr)2EtN的THF溶液混合，室温搅拌反应24h，纯化得到产物c即6
‑
((4
‑
(叔丁基)
‑
2，6二硝基苯基)氨基)己酸甲酯；
[0015]S4.产物c与LiOH溶于THF和H2O的混合溶液中，室温搅拌，水解完成后调PH＝5，乙酸乙酯萃取，干燥、旋干得仲丁灵半抗原。
[0016]在本专利技术的一个实施例中，所述步骤S1中，6
‑
氨基己酸、SOCl2的摩尔比为1∶2。
[0017]在本专利技术的一个实施例中，所述步骤S2中，2
‑
羟基
‑5‑
叔丁基
‑
1，3
‑
二硝基苯、SOCl2的摩尔比为1∶3。
[0018]在本专利技术的一个实施例中，所述步骤S3中，2
‑
氯
‑5‑
叔丁基
‑
1，3
‑
二硝基苯、(iPr)2EtN、氨基酸甲酯盐酸盐的摩尔比为1∶2.1∶3。
[0019]在本专利技术的一个实施例中，所述步骤S4中，产物c与LiOH的摩尔比为1∶2。
[0020]在本专利技术的一个实施例中，所述步骤S4中，THF和H2O的体积比为3∶1。
[0021]本专利技术的第五个目的是，提供一种仲丁灵完全抗原的制备方法，包括以下步骤：将仲丁灵半抗原、N
‑
羟基琥珀酰亚胺NHS及1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶解于N，N
‑
二甲基甲酰胺DMF中，搅拌反应，活化6
‑
8h后的活化液加入载体蛋白溶液中，室温搅拌反应后透析，即得所述仲丁灵完全抗原；
[0022]所述仲丁灵半抗原为上述的仲丁灵半抗原，结构如下式(I)所示：
[0023][0024]所述载体蛋白溶液由载体蛋白溶于碳酸盐缓冲溶液中制得，所述载体蛋白包括BSA、OVA其中任意一种。
[0025]在本专利技术的一个实施例中，所述仲丁灵半抗原与所述载体蛋白的摩尔比为30∶1。
[0026]在本专利技术的一个实施例中，所述仲丁灵半抗原、N
‑
羟基琥珀酰亚胺、1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1∶3∶3。
[0027]本专利技术的第六个目的是，提供一种仲丁灵完全抗原，根据上述的方法制备得到。
[0028]在本专利技术的一个实施例中，所述仲丁灵完全抗原的结构简式如下式(II)：
[0029][0030]在本专利技术的一个实施例中，一种分泌仲丁灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包含如下步骤：
[0031](1)设计仲丁灵半抗原与制备仲丁灵完全抗原(仲丁灵免疫原)，将获得的仲丁灵完全抗原配制弗氏佐剂与不完全弗氏佐剂；
[0032](2)将得到的弗氏佐剂通过背部皮下注射，注射进入BALB/c小鼠体内进行多次免疫，首次免疫采用完全弗氏佐剂，加强免疫采用不完全弗氏佐剂；
[0033](3)将经过上述免疫过程的小鼠进行采血，通过间接ELISA检测小鼠血清免疫效价和免疫抑制能力，筛选出血清中仲丁灵抗体含量高的获得免疫的小鼠；
[0034](4)将筛选出的小鼠用不完全弗氏佐剂再进行最后一次加强免疫，然后通过腹腔注射进行冲刺免疫，冲刺免疫采用不含弗氏佐剂的仲丁灵完全抗原进行；
[0035](5)将进行冲刺免疫后的BALB/c小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，将融合的细胞通过培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行亚克隆，最终筛选出获得能分泌仲丁灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0036]在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(2)、(4)中的首次免疫与加强免疫之间间隔一个月，加强免疫之间间隔21天，加强免疫与冲刺免疫之间间隔18～21天。
[0037]在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(2)、(4)中的首次免疫剂量为100μg/只，加强免疫剂量为50μg/只，冲刺免疫剂量为25μg/只。
[0038]在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(2)、(4)中的免疫过程，包含1次首次免疫、4次加强免疫和1次冲刺免疫；
[0039]在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(3)中的采血为第3次免疫过程结束后第7天进行采血。
[0040]在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(5)中的细胞融合是在冲刺免疫结束3天后进行。
[0041]在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(5)中的细胞融合是通过聚乙二醇(PEG4000)法进行的。
[0042]在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(5)中的培养基为RPMI
‑
1640培养基。
[0043]在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(5)中的亚克隆次数为3次。
[0044]本专利技术的第七个目的是，提供上述仲丁灵单克隆抗体的应用，具体是建立抗仲丁灵含量的免疫检测方法，用于食品中仲丁灵残留的检测。
[0045]在本专利技术的一个实施例中，采用仲丁灵单克隆抗体制备仲丁灵的免疫检测试剂盒、检测板以及胶体金试纸条用于检测。
[0046]在本专利技术的一种实施例中，所述检测主体还包括仲丁灵包被原，所述仲丁灵包被原由仲丁灵半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白包括KLH、BSA、OVA其中任意一种。其中，关于载体蛋白的选择，制备包被原所采用的载体蛋白与制备免疫原所采用的载体蛋白是不同的两种载体蛋白。
[0047]本专利技术的有益效果：
[0048](1)本专利技术获得的仲丁灵单克隆抗体，对仲丁灵有较好的检测灵敏度(IC
50
值为12.7ng/mL)，可实现对水、果蔬、谷物中仲丁灵残留量的检测，为食品中仲丁灵残留的免疫检测提本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株分泌抗仲丁灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株BZD，保藏日期为2021年12月16日，保藏编号为CGMCC No.45018。2.仲丁灵单克隆抗体，其特征在于：其由权利要求1所述保藏编号为CGMCC No.45018的杂交瘤细胞株BZD分泌产生。3.仲丁灵半抗原，用于制备如权利要求1所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，结构简式如下式(I)：4.一种如权利要求3所述的仲丁灵半抗原的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.将6
‑
氨基己酸溶于无水甲醇，冰浴下加入SOCl2，反应后旋干，得产物a即氨基酸甲酯盐酸盐；S2.将2
‑
羟基
‑5‑
叔丁基
‑
1，3
‑
二硝基苯溶于甲苯，加入DMF和SOCl2混合回流8h反应后冷却，旋干，残留液过滤、洗涤，得产物b即2
‑
氯
‑5‑
叔丁基
‑
1，3
‑
二硝基苯；S3.产物a用水溶解，浓氨水调节PH＝8.5，加入氯仿萃取，有机相旋干得到无色或淡黄色液体，再与添加有产物b及(iPr)2EtN的THF溶液混合，室温搅拌反应24h，纯化得到产物c即6
‑
((4
‑
(叔丁基)
‑
2，6二硝基苯基)氨基)己酸甲酯；S4.产物c与LiOH溶于THF和H2O的混合溶液中，室温搅拌，水解完成后调PH＝5，乙酸乙酯萃取，干燥、旋干得仲丁灵半抗原。5.一种如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中，6
‑
氨基己酸、SOCl2的摩尔比为1∶2。6.一种如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中，2
‑
羟基
‑5‑
叔丁基
‑
1，3
‑
二硝基苯、SOCl2的摩尔比为1∶3。7.一种如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中，2

【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，郭鑫，匡华，刘丽强，徐丽广，朱建平，郝昌龙，宋珊珊，胡拥明，吴爱红，郭玲玲，胥欣欣，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：