一种马立克病病毒gB蛋白的单克隆抗体及制备方法和应用技术

本发明专利技术公开一种抗马立克病病毒gB蛋白的单克隆抗体及制备方法和应用。所述的抗MDV gB蛋白的单克隆抗体5E8由小鼠杂交瘤细胞株gB

【技术实现步骤摘要】
一种马立克病病毒gB蛋白的单克隆抗体及制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及一种抗马立克病病毒gB蛋白的单克隆抗体及制备方法和应用，属于动物病毒免疫学


技术介绍

[0002]马立克病病毒(Marek
’
s disease virus，MDV)属于α疱疹病毒，MDV可经空气传播，传染能力强，早期感染雏鸡可引起严重的免疫抑制、外周神经肿大和内脏器官肿瘤为特征的鸡马立克病，最终会导致感染鸡群大批死亡，全球养禽业每年因此约导致10～20亿美元的直接经济损失。MDV共有3种血清型：血清I型(MDV
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1)、血清II型(MDV
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2)和血清III型(MDV
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3)，其中只有MDV
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1具有致病性和致瘤性。根据MDV
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1分离株致病性的不同，MDV
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1又可分为弱毒MDV(mMDV)、强毒MDV(vMDV)、超强毒MDV(vvMDV)以及特超强毒MDV(vv+MDV)。
[0003]MDV基因组为线性双股DNA，全长约180kb。主要由一个长独特序列区(Unique long，UL)和一个短独特序列区(Unique short，US)构成，在两个独特序列区的两侧，分别是两个序列完全相同的反转重复序列区，包括：长末端重复序列(Terminal repeat long，TRL)和长内部重复序列(Internal repeat long，IRL)以及短末端重复序列(Terminal repeat short，TRS)和短内部重复序列(Terminal repeat short，IRS)，独特序列区中编码的MDV基因与其它疱疹病毒具有高度的保守性，而MDV特异性的病毒基因则主要位于反转重复序列区TR/IR中。
[0004]MDV基因组较大，编码近200个ORF，包括一部分结构基因和功能基因，这其中有一类是编码囊膜糖蛋白的结构基因，如：gB、gC、gD、gE、gI、gK、gL和gM等基因。gB是MDV最保守的一个结构基因，是MDV重要的具有中和活性的抗原基因，在感染和抗感染中和反应中起着重要的免疫保护作用。gB蛋白是由三种分子量不同的糖蛋白(gP100、gP60和gP49)组成的糖蛋白复合物，是一种非分泌性抗原，存在于MDV感染细胞的细胞膜表面和细胞浆内，因为它能引起体液免疫和细胞免疫，因而在MDV基因工程疫苗研制中成为一个十分重要的抗原，它也是目前发现的最重要的保护性抗原。
[0005]MDV和其他疱疹病毒一样，是严格的细胞结合性病毒。gB蛋白是MDV编码的具有重要中和活性的囊膜糖蛋白，在MDV基因工程疫苗研制和病毒检测与诊断中也是非常重要的免疫保护性抗原和诊断标识。因此，制备MDV gB蛋白的特异性单克隆抗体，不仅可用于gB蛋白中和抗原表位筛选与鉴定及功能研究，还可用于MDV基因工程疫苗研制。尤其是对于MDV的鉴别诊断技术和产品研发，可以提供重要的关键核心试剂。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种稳定分泌抗马立克病病毒gB蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株gB
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5E8和单克隆抗体5E8的制备方法及应用。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
[0008]利用MDV为严格的细胞结合性疱疹病毒的特性，收集MDV感染的CEF，利用细胞核蛋
白和细胞浆蛋白提取试剂盒分离提取细胞浆蛋白，免疫BALB/c小鼠，利用细胞融合技术建立抗MDV病毒蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株和单克隆抗体库；同时利用MDV感染CEF病毒噬斑和pEGFP
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N1
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gB真核表达质粒转染的293T细胞做间接免疫荧光实验(IFA)，从抗体库中筛选获得可稳定分泌并特异性识别MDV gB蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株gB
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5E8，最终制备获得的单克隆抗体5E8可应用于间接免疫荧光实验IFA和蛋白质印迹分析Western
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blot等免疫学检测技术和方法中，为后续MDV gB蛋白的结构和功能研究、中和抗原表位筛选与鉴定、以及MDV鉴别诊断技术和产品研发提供关键核心试剂，同时也为MDV及类似病毒的单克隆抗体的筛选、鉴定和制备提供了一种新的策略和技术方法。
[0009]一株分泌抗马立克病病毒MDV gB蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株为鼠源单克隆抗体杂交瘤细胞株gB
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5E8，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23024。
[0010]一种抗马立克病病毒MDV gB蛋白的单克隆抗体5E8，所述单克隆抗体5E8是由权利要求1所述鼠源单克隆抗体杂交瘤细胞株gB
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5E8所分泌；所述单克隆抗体5E8的轻链型为Kappa，亚型为IgG1。
[0011]所述单克隆抗体5E8的重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0012]所述单克隆抗体5E8的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0013]所述的单克隆抗体5E8的制备方法，包括以下步骤：
[0014](1)利用血清1型马立克病病毒超强毒株GX0101感染鸡胚成纤维细胞CEF，随后提取、分离纯化细胞浆蛋白，以所述细胞浆蛋白为免疫原免疫BALB/C小鼠，结合间接免疫荧光实验IFA对免疫小鼠多抗血清进行检测，选择IFA效价最高的小鼠，备用；
[0015](2)利用细胞融合技术对步骤(1)效价最高的小鼠进行处理，制备杂交瘤及细胞上清，结合间接免疫荧光实验IFA检测细胞上清，筛选得到阳性杂交瘤细胞；结合2～3轮亚克隆，构建针对MDV病毒蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞库和单克隆抗体库；
[0016](3)根据NCBI注册的GX0101的基因组序列，GenBank登录号：JX844666.1，合成gB基因全长序列，构建pEGFP
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N1
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gB真核表达质粒；利用pEGFP
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N1
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gB真核表达质粒转染293T细胞，瞬时表达MDV gB蛋白后固定细胞，对步骤(2)获得的MDV单克隆抗体杂交瘤细胞上清进行间接免疫荧光实验IFA鉴定，筛选获得一株抗马立克病病毒gB蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株gB
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5E8；
[0017](4)选择经产BALB/c母鼠，腹腔注射杂交瘤细胞株gB
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5E8制备5E8单克隆抗体腹水。
[0018]所述的单克隆抗体5E8在马立克病病毒免疫学检测中的应用。
[0019]所述免疫学检测包括但不仅限于间接免疫荧光实验IFA、蛋白质印迹分析Western
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blot、酶联免疫吸附实验ELISA或免疫层析试纸技术。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株分泌抗马立克病病毒MDV gB蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株为鼠源单克隆抗体杂交瘤细胞株gB
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5E8，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23024。2.一种抗马立克病病毒MDV gB蛋白的单克隆抗体5E8，其特征在于，所述单克隆抗体5E8是由权利要求1所述鼠源单克隆抗体杂交瘤细胞株gB
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5E8所分泌；所述单克隆抗体5E8的轻链型为Kappa，亚型为IgG1。3.如权利要求2所述的单克隆抗体5E8，其特征在于，所述单克隆抗体5E8的重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.如权利要求2所述的单克隆抗体5E8，其特征在于，所述单克隆抗体5E8的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。5.如权利要求2所述的单克隆抗体5E8的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用血清1型马立克病病毒超强毒株GX0101感染鸡胚成纤维细胞CEF，随后提取、分离纯化细胞浆蛋白，以所述细胞浆蛋白为免疫原免疫BALB/C小鼠，结合间接免疫荧光实验IFA对免疫小鼠多抗血清进行检测，选择IFA效价最高的小鼠，备用；(2)利用细胞融合技术对步骤(1)效价最高的小鼠进行处理，制备杂交瘤及细胞上清，结合间接免疫荧光实验I...

【专利技术属性】
技术研发人员：滕蔓，罗俊，白依霖，张改平，刘金玲，郑鹿平，柴书军，程娜，邢广旭，赵东，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：