一种血清1型马立克病病毒pp38单克隆抗体的制备方法及应用技术

本发明专利技术属于基因编辑技术在动物免疫学技术领域中的新应用，公开了一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术筛选和鉴定抗血清1型马立克病病毒特异性pp38蛋白单克隆抗体的方法及应用。其中抗MDV

【技术实现步骤摘要】
一种血清1型马立克病病毒pp38单克隆抗体的制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建血清1型马立克病病毒MDV
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1特异性pp38基因编辑缺失毒株，进行MDV
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1特异性pp38蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选、鉴定、单克隆抗体制备及应用，属于基因工程


技术介绍

[0002]鸡马立克病(Marek
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s disease，MD)是由马立克病病毒(Marek
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s disease virus，MDV)早期感染雏鸡引发的一种最重要的免疫抑制病及肿瘤病。主要特征是外周神经、内脏器官(性腺、肝、脾、肺、肾、腺胃、肠道等)、虹膜、肌肉及皮肤内发生淋巴样细胞浸润，并最终发展成为淋巴瘤。MDV可经空气传播，传染能力强，最终会诱发宿主产生内脏肿瘤和大批死亡，对全球养禽业年均导致约10
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20亿美元的巨大经济损失，加上MDV感染宿主后产生免疫抑制导致临床疫苗免疫预防效果不佳而产生间接影响，经济损失无法估量。
[0003]MDV共有三种不同的血清型：血清1型(MDV
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1)、血清2型(MDV
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2)和血清3型(MDV
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3，即火鸡疱疹病毒HVT)。其中，只有MDV
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1毒株具有致病性和致瘤性。根据致病性的不同，MDV
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1毒株又可分为温和毒(Mild MDV，mMDV)、强毒(Virulent MDV，vMDV)、超强毒(Very virulent MDV，vvMDV)以及特超强毒(Very virulent plus MDV，vv+MDV)。
[0004]MDV病毒基因组为线性双股DNA，全长约180kb。主要由一个长独特序列区(Unique long，UL)和一个短独特序列区(Unique short，US)构成，在两个独特序列区两侧分别是两个序列完全相同的反转重复序列区：长末端重复序列(Terminal repeat long，TRL)和长内部重复序列(Internal repeat long，IRL)以及短末端重复序列(Terminal repeat short，TRS)和短内部重复序列(Terminal repeat short，IRS)，独特序列区中编码的病毒基因与其它疱疹病毒具有高度保守性，而MDV特异性的病毒基因则主要位于反转重复序列区TR/IR中。三种血清型MDV存在大部分相同的结构基因和功能基因外，致病性的MDV
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1还被发现和鉴定编码7个病毒特异性的基因，包括原癌基因meq、pp38基因、病毒端粒酶RNA(vTR)、病毒脂肪酶(vLIP)、病毒相关IL8基因(vIL8)和1.8kb mRNA以及潜伏感染相关转录因子(LATs)。
[0005]在MDV
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1特异性基因中，38ku磷蛋白pp38是最早被发现的。pp38在MD肿瘤和细胞系中的表达存在差异，且是迄今为止在MDV诱发的肿瘤及非生产性肿瘤细胞系中唯一能检出的MDV
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1特异性抗原，参与淋巴瘤细胞MSB
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1转化状态的维持。此外，pp38还参与淋巴细胞的早期细胞裂解性感染，对于产生足够量的潜伏感染T细胞以及体内转化状态的维持来说是必需的。
[0006]pp38蛋白是MDV
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1特有的病毒蛋白，制备识别该病毒蛋白的特异性单克隆抗抗，不仅可用于MDV
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1特异性毒株的快速鉴定，还可以为进一步研究揭示pp38蛋白的功能，以及为MDV快速检测诊断试剂的研发提供关键核心试剂。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建血清1型马立克病病毒MDV
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1特异性pp38基因编辑的缺失毒株，并将其应用于MDV
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1特异性pp38蛋白单克隆抗体的快速筛选、鉴定及应用。
[0008]还提供一种稳定分泌抗血清1型马立克病病毒MDV
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1特异性pp38蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株pp38
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31G7和单克隆抗体31G7的制备及应用方法。
[0009]为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
[0010]利用MDV为严格的细胞结合性疱疹病毒的特性，收集MDV感染的CEF，利用细胞核蛋白和细胞浆蛋白提取试剂盒提取细胞浆蛋白，免疫BALB/c小鼠，利用细胞融合技术建立抗MDV病毒蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株和单克隆抗体库；同时以MDV
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1特异性pp38基因为靶点，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建pp38基因编辑缺失的MDV
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1毒株GX0101Δpp38，然后用亲本毒株GX0101和pp38基因编辑缺失毒株GX0101Δpp38做间接免疫荧光实验IFA进行交叉筛选，从MDV单克隆抗体杂交瘤细胞库中筛选鉴定可特异性识别pp38蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株pp38
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31G7，最终制备获得的特异性单克隆抗体31G7可应用于间接免疫荧光实验IFA、免疫组织化学IHC、蛋白质印迹分析Western
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blot以及免疫共沉淀IP等免疫学检测方法中，为pp38蛋白的功能研究、MDV快速检测和诊断试剂研发提供了关键核心试剂，同时也为MDV及类似病毒的单克隆抗体筛选、制备和鉴定提供了一种新的策略和技术方法。
[0011]一种分泌抗血清1型马立克病病毒pp38蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株为鼠源单克隆抗体杂交瘤细胞株pp38
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31G7，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23025。
[0012]所述单克隆抗体31G7是由权利要求1所述鼠源单克隆抗体杂交瘤细胞株pp38
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31G7所分泌；所述单克隆抗体31G7的轻链为Kappa型，亚型为IgG1。
[0013]所述单克隆抗体31G7的重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0014]所述单克隆抗体31G7的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0015]所述的单克隆抗体31G7的制备方法，包括以下步骤：
[0016](1)用血清1型马立克病病毒超强毒株GX0101感染鸡胚成纤维细胞CEF，随后提取病毒感染CEF的细胞浆蛋白，以所述细胞浆蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠，利用细胞融合技术制备杂交瘤细胞，筛选培养上清阳性的杂交瘤细胞，结合2～3轮亚克隆，筛选并构建特异针对病毒蛋白的杂交瘤细胞株和单克隆抗体库；
[0017](2)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建血清1型马立克病病毒特异性pp本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分泌抗血清1型马立克病病毒pp38蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株为鼠源单克隆抗体杂交瘤细胞株pp38
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31G7，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23025。2.一种抗血清1型马立克病病毒pp38蛋白的单克隆抗体31G7，其特征在于，所述单克隆抗体31G7是由权利要求1所述鼠源单克隆抗体杂交瘤细胞株pp38
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31G7所分泌；所述单克隆抗体31G7的轻链为Kappa型，亚型为IgG1。3.如权利要求2所述的单克隆抗体31G7，其特征在于，所述单克隆抗体31G7的重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.如权利要求2所述的单克隆抗体31G7，其特征在于，所述单克隆抗体31G7的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。5.如权利要求2所述的单克隆抗体31G7的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)用血清1型马立克病病毒超强毒株GX0101感染鸡胚成纤维细胞CEF，随后提取病毒感染CEF的细胞浆蛋白，以所述细胞浆蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠，利用细胞融合技术制备杂交瘤细胞，筛选培养上清阳性的杂交瘤细胞，结合2～3轮亚克隆，筛选并构建特异针对病毒蛋白的杂交瘤细胞株和单克隆抗体库；(2)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建血清1型马立克病病毒特异性pp38基因编辑缺失的毒株GX0101Δpp38；(3)利用间接免疫荧光实验IFA，以野生型亲本毒株GX0101和突变型基因编辑缺失毒株GX0101Δpp38，对步骤(1)所得杂交瘤细胞株和单克隆抗体库进行差异筛选和交叉鉴定，即得。6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)免疫原的制备方法为：将GX0101接种于单层鸡胚成纤维细胞CEF，置37℃、5％(v/v)CO2培养箱中培养3
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4d；出现典型病毒噬斑后，收集细胞，以1000rpm的速度离心10min，收集细胞沉淀，提取病毒感...

【专利技术属性】
技术研发人员：滕蔓，罗俊，罗琴，张改平，郑鹿平，刘金玲，卢清侠，柴书军，赵东，程娜，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：