一种血清1型马立克病病毒MEQ单克隆抗体、制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种抗血清1型马立克病病毒MEQ蛋白单克隆抗体、制备方法及应用。所述抗MDV

【技术实现步骤摘要】
一种血清1型马立克病病毒MEQ单克隆抗体、制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及一种血清1型马立克病病毒MEQ单克隆抗体、制备方法及应用，属于动物免疫学


技术介绍

[0002]鸡马立克病(Marek
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s disease，MD)是由马立克病病毒(Marek
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s disease virus，MDV) 早期感染雏鸡引发的一种重要的免疫抑制病及肿瘤病。MDV早期感染宿主后产生严重的免疫抑制，是临床禽病疫苗免疫预防效果不佳的重要因素之一，长期以来一直困扰着我国养禽业的健康发展。同时，MDV感染自然宿主后会诱发内脏肿瘤和大批死亡，导致全球养禽业年均直接经济损失约10
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20亿美元。MDV诱发宿主肿瘤的发生可以用疫苗进行有效的免疫预防，是世界上首个可以用疫苗成功预防致瘤性病毒引发癌症的例子，但是近年来随着MD疫苗在鸡群中的广泛应用，在长期的免疫压力选择下，MDV流行毒株的毒力正不断增强和变异，MD 疫情在全球范围内仍不断暴发。
[0003]MDV共有3种不同的血清型：血清1型(MDV
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1)、血清2型(MDV
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2)和血清3型(MDV
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3，即火鸡疱疹病毒HVT)，其中只有MDV
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1具有致病性和致瘤性。根据致病性的不同，MDV
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1 流行毒株又可分为温和毒(Mild MDV，mMDV)、强毒(Virulent MDV，vMDV)、超强毒(Veryvirulent MDV，vvMDV)以及特超强毒(Very virulent plus MDV，vv+MDV)。
[0004]MDV病毒基因组为线性双股DNA，全长约180kb。主要由一个长独特序列区(Uniquelong，UL)和一个短独特序列区(Unique short，US)构成，在两个独特序列区两侧分别是两个序列完全相同的反转重复序列区：长末端重复序列(Terminal repeat long，TRL)和长内部重复序列(Internal repeat long，IRL)以及短末端重复序列(Terminal repeat short， TRS)和短内部重复序列(Terminal repeat short，IRS)，独特序列区中编码的病毒基因与其它疱疹病毒具有高度保守性，而MDV特异性的病毒基因则主要位于反转重复序列区 TR/IR中。
[0005]在MDV编码的众多病毒基因中，meq基因(MDV EcoRI
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Q)是MDV最主要的原癌基因，其它的一些基因如pp38、vIL
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8、ICP4相关转录物以及病毒编码的端粒酶RNA等也可能在MDV潜伏感染及肿瘤发生中发挥重要作用。meq基因是目前公认的致瘤基因，在MD 肿瘤发生发展过程中具有直接作用。meq基因序列全长1020bp，编码339个氨基酸组成的蛋白质，N末端为碱性亮氨酸链(basiz leucine zipper,bZIP)结构，C末端为2个富含脯氨酸的重复序列，其编码的MEQ蛋白与宿主原癌基因家族中的肿瘤蛋白FOS和JUN结构相似，故认为MEQ是一种位于细胞核的核质、核仁和螺旋体中的致瘤蛋白和转录激活因子，通过激活AP
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1同时抑制p53促进抗凋亡发生，是MDV肿瘤发生过程中的主要原癌蛋白。meq基因是MDV
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1所特有的蛋白基因，虽然不同毒株之间meq基因序列相对较为保守，核苷酸同源性约83.8％～99.9％，氨基酸同源性约88.4％～99.6％，但是不同毒力的MDV毒株在MEQ蛋白氨基酸序列结构上存在一定的差异性。目前，MDV正在呈现周期性、爬升式的毒力不断增强趋势，更强毒力MDV流行毒株的出现，可能会使现有疫苗无法提供有效免疫保护从而造成更大的经济损失。因此，
深入研究MEQ蛋白的结构和功能，对揭示目前MDV
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1毒力增强的机制具有重要的科学意义。
[0006]MEQ是目前学界公认的MDV
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1特异性原癌蛋白，在MDV感染发病鸡内脏实质肿瘤组织和细胞中通常发生异常高表达，是极佳的MD诊断标志物，临床上可用于与禽白血病病毒(ALV)或网状内皮组织增生症病病毒(REV)等感染导致的家禽免疫抑制病与肿瘤病的鉴别诊断。因此，研制特异性针对MEQ蛋白的抗体(单抗或多抗)，在家禽免疫抑制病与肿瘤病的鉴别诊断、MDV感染与疫苗免疫的鉴别、MDV流行毒株的分离鉴定与分型，以及MDV的致病与致癌机制研究中都具有重要的科学价值和市场应用前景。
[0007]虽然国内学者已多次尝试研制该蛋白的抗体，但由于meq基因序列GC含量较高、蛋白质较大、人工表达和纯化较为困难等因素，我国目前仍没能研制出实际可用的MEQ抗体，市场上更无可利用的商品化产品。目前国际上仅有美国农业部禽病肿瘤实验室和英国皮尔布赖特研究所两家机构的世界动物卫生组织(OIE)MDV参考实验室成功研制了该蛋白的单克隆抗体，但没有进行商业化，我国学者开展相关研究，所需抗体只能依赖于这两家机构的欧美学者友情馈赠，这大大限制了我国学者的研究需求。研发具有自主知识产权的MEQ单抗已迫在眉睫。MEQ单抗的研发不仅可为MD的有效防控提供关键核心试剂，同时也可为保障我国家禽养殖业健康发展提供技术支撑。

技术实现思路

[0008]针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种稳定分泌抗血清1型马立克病病毒特异性 MEQ蛋白的杂交瘤细胞株meq
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2A9
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B12、单克隆抗体2A9
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B12、制备方法及应用。
[0009]为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
[0010]通过对血清I型马立克病病毒MDV
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1不同毒力毒株MEQ蛋白的氨基酸序列进行比对，选取保守且具备亲水性的序列区域进行多肽分段合成，然后将合成多肽偶联至KLH蛋白增加其免疫原性，用多肽
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KLH偶联蛋白免疫BALB/c小鼠，利用细胞融合技术建立单克隆抗体杂交瘤细胞株，同时使用前期构建的meq基因编辑缺失的GX0101Δmeq毒株及其亲本毒株GX0101进行间接免疫荧光实验(IFA)，交叉筛选和鉴定获得可特异性识别 MDV
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1MEQ蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株meq
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2A9
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B12，稳定分泌的特异性单克隆抗体2A9
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B12可应用于IFA和蛋白质印迹分析(Western
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blot)等免疫学检测，为后续MEQ 蛋白的结构与功能研究、MDV快速检测和鉴别诊断试剂的研发提供了关键核心试剂，同时也为MDV及类似病毒的单克隆抗体的筛选、鉴定和制备提供了一种新的策略和方法。
[0011]一种分泌抗血清Ⅰ型马立克病病毒MDV
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1特异性MEQ蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株为鼠源单克隆抗体杂交瘤细胞株meq本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分泌抗血清Ⅰ型马立克病病毒MDV
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1特异性MEQ蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株为鼠源单克隆抗体杂交瘤细胞株meq
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B12，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23023。2.一种抗血清Ⅰ型马立克病病毒MDV
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1特异性MEQ蛋白的单克隆抗体2A9
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B12，其特征在于，所述单克隆抗体2A9
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B12是由权利要求1所述鼠源单克隆抗体杂交瘤细胞株meq
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2A9
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B12所分泌；所述单克隆抗体2A9
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B12的轻链型为Kappa型，亚型为IgG2b。3.如权利要求2所述的单克隆抗体2A9
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B12，其特征在于，所述的单克隆抗体2A9
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B12的重链可变区核苷酸序列为如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区核苷酸序列为如SEQ ID NO.2所示。4.如权利要求2所述的单克隆抗体2A9
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B12，其特征在于，所述的单克隆抗体2A9
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B12的重链可变区氨基酸序列为如SEQ ID NO.3所示，轻链可变区氨基酸序列为如SEQ ID NO.4所示。5.如权利要求1所述的鼠源单克隆抗体杂交瘤细胞株meq
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2A9
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B12的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)比对强毒株GA、超强毒株GX0101、Md5以及特超强毒株648A共4种不同致病型的血清Ⅰ型马立克病病毒MDV
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1特异性毒株的meq基因序列，分析MEQ蛋白的亲水区和疏水区，设计4条亲水性免疫原多肽，合成4条MEQ蛋白多肽的氨基酸序列分别为：SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8；(2)将合成的4条MEQ蛋白多肽分别偶联至KLH蛋白，得到4种多肽
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【专利技术属性】
技术研发人员：罗俊，滕蔓，刘金玲，张改平，罗琴，郑鹿平，邢广旭，卢清侠，赵东，柴书军，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：