基于CRISPRCas12a系统的miRNA-21检测方法及试剂盒技术方案

本发明专利技术公开了一种基于CRISPRCas12a系统的miRNA

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPRCas12a系统的miRNA
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21检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术涉及一种基于CRISPRCas12a系统的miRNA
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21检测方法及试剂盒，属于生物检测


技术介绍

[0002]微小RNA(miRNA)是一种内源性、非编码的RNA分子，其作为基因转录后重要的调节因子，在细胞分化、增殖、死亡及器官发育、代谢等多种生物学过程中发挥着重要作用。最近的研究表明，外周血环境中的循环miRNA可存在于微囊(外泌体和脱落囊泡)和凋亡小体中或与高浓度脂蛋白偶联，具有较高的稳定性，与蛋白质标志物、循环细胞和循环DNA相比，miRNA是液体活检领域最具应用潜力的生物标志物之一。
[0003]尽管miRNA作为生物标志物具有极大的应用前景，但miRNA检测在临床应用的广泛普及仍面临一些挑战。miRNA序列较短，一般为19
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23个碱基，难以通过传统PCR技术进行检测；且miRNA表现出高度的同源性，特别是属于同一家族的成员，如Let
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7家族中的Let
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7a和Let
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7e，二者除了第9个核苷酸有差异外，其余序列均是完全相同的。因此，需要高特异性的检测方法以对同一家族中序列相似的miRNA进行有效识别；miRNA的丰度仅占RNA总丰度的0.01％，在血液环境中的miRNA浓度在亚皮摩尔(pM)范围内，且需要从高度复杂的生物环境中进行提取。此外，不同的miRNA表达丰度差异较大。因此，miRNA检测方法除了具有足够的灵敏度外，还需要兼具至少四个数量级的动态范围。miRNA检测技术根据其检测原理可分为三类：基于杂交原理的检测技术，包括Northern印迹分析、微阵列芯片等检测方法；基于扩增原理的检测技术，主要是RT
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PCR方法；基于测序的检测技术，包括扩增克隆测序法、新一代大规模测序技术。
[0004]Northern印迹杂交技术是最早应用于miRNA检测的技术，且仍是miRNA表达谱分析的金标准。该项技术可对靶标miRNA的表达特性及分子大小进行确定，并对所预测的miRNA进行验证。然而，由于成熟的miRNA分子较短，在总RNA中的表达丰度较低，导致Northern印迹分析的灵敏度较低，且这种方法耗时耗力，无法应用于实际临床中大量miRNA样本的检测。微阵列技术主要基于分子靶标与其对应的互补探针间的核酸杂交，以对大量miRNAs进行筛选，实现miRNAs的高通量检测。但该技术在miRNA检测中也面临以下挑战：长度较短的miRNAs几乎没有空间对所有miRNAs的杂交条件进行微调，且不同miRNAs的表达丰度相差较大，这显著降低了微阵列的灵敏度和特异性；微阵列技术缺乏提供定量数据的能力，信号的强度不能代表样本中miRNAs的表达水平；此外，微阵列芯片的加工制造成本昂贵，限制了其在临床中的广泛推广。实时荧光定量PCR技术(qRT
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PCR)具有较高的灵敏度、准确性和实用性，是基因定量检测的金标准。由于miRNA的长度只有20个碱基左右，无法采用常规qRT
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PCR技术对其进行检测，目前多采用特殊的茎环引物法或加尾法对模板链进行延长，以实现对miRNA的定量分析。但以上方法仍面临一些短板：如茎环引物的设计较为复杂，不同序列的引物设计会导致较大的检测性能差异，且引物通用性差，大量检测时成本较高；加尾法虽然引物设计简单，但其检测的特异性及灵敏度显著低于茎环法。以上问题均限制了基于qRT
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PCR的miRNA检测方法在临床转化中的进一步应用。而测序技术凭借通量高、准确性高等特点对miRNA的检测性能显著提升，但该方法耗时长、成本高、且需要复杂的数据分析。

技术实现思路

[0005]本专利技术是提供一种基于CRISPRCas12a系统的miRNA
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21检测方法，可在短时间内实现对miRNA
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21的高灵敏、高特异性检测。
[0006]为达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种基于CRISPRCas12a系统的miRNA
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21检测方法，包括以下步骤：合成正向切口引物、反向切口引物以及对应的向导RNA；对所述正向切口引物和反向切口引物进行等温扩增；将等温扩增后的产物以及所述向导RNA，采用CRISPRCas12a系统进行检测，获得miRNA
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21检测结果；所述等温扩增的温度为48℃
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65℃，时间为10min
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50min。
[0007]进一步地，所述等温扩增具体包括以下步骤：配制等温扩增的反应液；在配置好的反应液中加入miRNA
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21靶标后，置于恒温金属浴、水浴或PCR核酸扩增仪上进行扩增；所述反应液包括正向切口引物、反向切口引物、Bst DNA聚合酶、切口酶以及dNTP混合液。
[0008]进一步地，所述等温扩增的温度为61.1℃
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65℃，时间为20min
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50min。本方法主要基于Bst聚合酶和切口酶介导的双重链置换扩增反应，其中温度是维持该多酶系统稳定及引物高效发挥作用的关键，过低的温度会影响Bst聚合酶及切口酶的活性，而较高的温度会破坏引物识别区与miRNA靶标的结合及固定区介导的SDA效率。为进一步降低非特异的扩增信号，节约时间成本，本专利技术对双重链置换扩增的反应时间进行了优化。随着时间的延长，相对荧光强度及Cas12a的切割速率会有上升，但随着时间的进一步延长，增长趋势放缓。
[0009]进一步地，所述采用CRISPRCas12a系统进行检测，具体包括以下步骤：将向导RNA、Cas12a核酸酶、非特异性荧光报告分子混合后，加入等温扩增的产物混合液孵育；孵育完成后在荧光定量PCR仪或荧光分光光度计上进行荧光分析。
[0010]进一步地，所述正向切口引物和反向切口引物从5
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至3
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端至少包括链置换固定区、切口酶识别区及靶标识别区；所述链置换固定区的Tm值为50℃～55℃。若固定区的Tm值过低，则会导致引物从互补链上脱离，扩增效率显著下降；而Tm值过高，则会导致引物二级结构或非特异结合位点的增多，导致扩增效率降低或非特异扩增信号增强。
[0011]本专利技术还涉及一种试剂盒，包括权正向切口引物、反向切口引物、导向RNA，以及非特异性荧光报告分子、DNA/RNA聚合酶、切口酶、Cas12a核酸酶、dNTP、阴性对照、反应缓冲液；所述正向切口引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述反向切口引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；向导RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0012]优选地，所述反应缓冲液为25～75mM醋酸钾、5～20mM醋酸镁、50～150μg/ml牛血清白蛋白和10～30mM Tris
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乙酸的混合溶液；所述反应缓冲液本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPRCas12a系统的miRNA
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21检测方法，其特征在于，包括以下步骤：合成正向切口引物、反向切口引物以及对应的向导RNA；对所述正向切口引物和反向切口引物进行等温扩增；将等温扩增后的产物以及所述向导RNA，采用CRISPRCas12a系统进行检测，获得miRNA
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21检测结果；所述等温扩增的温度为48℃
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65℃，时间为10 min
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50 min。2.根据权利要求1所述基于CRISPRCas12a系统的miRNA
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21检测方法，其特征在于，所述等温扩增具体包括以下步骤：配制等温扩增的反应液；在配置好的反应液中加入miRNA
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21靶标后，置于恒温金属浴、水浴或PCR核酸扩增仪上进行扩增；所述反应液包括正向切口引物、反向切口引物、Bst DNA聚合酶、切口酶以及dNTP混合液。3.根据权利要求1所述基于CRISPRCas12a系统的miRNA
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21检测方法，其特征在于：所述等温扩增的温度为61.1℃
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65℃，时间为20 min
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50 min。4.根据权利要求1所述基于CRISPRCas12a系统的miRNA
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21检测方法，其特征在于：所述采用CRISPRCas12a系统进行检测，具体包括以下步骤：将向导RNA、Cas12a核酸酶、非特异性荧光报告分子混合后，加入等温扩增的产物混合液孵育；孵育完成后在荧光定量PCR仪或荧光分光光度计上进行荧光分析。5.根据权利要求1所述基于CRISPRCas12a系统的miRNA
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【专利技术属性】
技术研发人员：左晨，李俊杰，兰华林，张力心，赵朝辉，钟越，杨燕斌，谢国明，
申请(专利权)人：重庆创芯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：