【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基于熔解曲线分析的核酸多重检测方法、探针组及试剂盒，属于核酸分子的多重检测领域。
技术介绍
1、pcr技术作为核酸检测的一种常用方法，其操作简便，应用广泛。多重pcr其基本原理与常规pcr相同，区别在于多重pcr反应体系加入一对以上引物，各对引物分别结合在模板对应部位，最终扩增出多条目的dna片段。
2、实时荧光定量pcr是一种在dna扩增反应中，以荧光化学物质检测每次pcr循环后产物总量的方法。检测作为荧光定量pcr被广泛应用，taqman探针特异性地与pcr扩增的靶序列结合，可避免非特异性扩增导致的信号干扰，具有特异性高，重复性好等优点。但是，对于多重实时pcr而言，针对每一种靶序列，需使用不同的荧光基团标记相应的taqman探针，因此，该方法在单轮/孔检测中能检测的最大靶标数目受限于实时pcr仪器的荧光通道的数目，一般不超过6个，导致该方法的检测通量较低。
3、熔解曲线分析(mca)，是指在pcr扩增后通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生熔解曲线的步骤，以此来分析由探针与靶序列构成的双链体的熔点。mca模式可通过荧光通道和熔解峰来识别靶序列，该模式虽然相对较为繁琐，但其在单轮检测中能检测的最大靶序列的数目有所提高。
4、faltin等人(clinical chemistry 2012,58(11):1546-1556)描述了一种基于“媒介探针”的实时pcr检测方法。该方法针对每一个靶序列设计了两种探针：媒介探针以及荧光探针；在pcr过程中，媒介探针通过靶序列特异性
5、与faltin等人的方法类似，us2013/0109588 a1公开了一种可用于熔解曲线分析的实时荧光pcr测定方法，通过设计两条探针(pto探针和cto探针)来实现对靶序列的检测。当将该专利申请中描述的方法用于实施区分每个靶序列的多重实时pcr时，针对每一个靶序列需要分别设计一条pto探针和一条cto探针，即使用双倍数目的探针。例如，该专利申请描述了同时检测奈瑟氏淋球菌和金黄色葡萄球菌的双重实时pcr，其中即使用了2条pto探针和2条cto探针。在这种情况下，与针对每一个靶序列使用单条荧光探针的传统多重pcr相比，该专利的方法更复杂，并且成本昂贵。针对每一个靶序列都需要设计一个携带靶核酸特异性结合序列的媒介探针和一个对应的、带有独特荧光信号的荧光探针。在这种情况下，与针对每一个靶序列使用单个探针的传统多重实时pcr相比，faltin等人的方法需要使用双倍数目的探针。相应地，整个反应体系变得更为复杂，检测成本也变得更高。
6、huang q等人的研究(pnas2022,119(9)e2110672119)及cn 108823287 b公开了一种可用于熔解曲线分析的实时pcr方法，该方法提供了一种发夹结构的检测探针(修饰有荧光基团和猝灭基团)，并且针对每一种靶序列，分别设计了一条媒介探针；其中，每一条媒介探针各自包含一个独特的媒介子序列，并可分别杂交至检测探针“loop”区域的不同位置，并被核酸聚合酶延伸，从而产生多种延伸产物；由于延伸产物具有不同的长度，由此可通过熔解曲线分析，并进而可确定与各个熔解峰对应的靶核酸的存在。因此，该方法可使用一种检测探针和多种媒介探针实现对多种靶核酸的检测。
7、总的来说，与传统实时pcr法相比，使用两条或三条探针的经改良的实时pcr方法(如faltin等人的方法)在实施单重实时pcr时，需要使用双倍乃至三倍数目的探针，反而比传统实时pcr法更加复杂，成本更高。而改良后的多色熔解曲线检测方法(如cn 108823287b中的方法)，只需要一条通用的荧光探针及多条媒介探针就可实现对多种靶核酸的检测，但剪切后的媒介子序列与检测探针杂交后，需在核酸聚合酶作用下产生多种延伸产物，由于此“延伸”步骤(35℃下孵育10-30分钟)，导致检测时间较长，也使媒介探针及检测探针的设计更为复杂。
技术实现思路
1、本专利技术是提供一种探针组，在省略了媒介子序列与检测探针杂交后的延伸步骤的基础上，实现对多种靶核酸的检测。
2、为达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案是一种探针组，包含一种信号探针和至少一种媒介探针，所述媒介探针从5'至3'方向包含媒介子序列和靶核酸特异性结合序列，所述媒介子序列包含不与靶核酸序列互补的序列；所述靶核酸特异性结合序列包含与靶核酸序列互补的序列和信号猝灭基团，所述信号猝灭基团位于靶核酸特异性结合序列区域上；所有媒介探针包含的媒介子序列彼此不同，但均可与信号探针杂交；探针组内所有媒介探针包含的靶核酸特异性结合序列彼此不同；所述信号探针与每一种所述媒介子序列完全或部分互补；所述信号探针标记有报告基团和猝灭基团。
3、优选地，所述猝灭基团修饰于媒介探针第5-140位碱基上。
4、优选地，所述媒介探针中的靶核酸特异性结合序列的长度为10-100nt；所述媒介子序列的长度为5-100nt。
5、优选地，所述信号探针为自猝灭探针，所述报告基团和猝灭基团相距大于或等于5-80nt。
6、本专利技术提供了一种试剂盒，包含上述的探针组。
7、优选地，试剂盒内所有媒介子序列各自靶向不同的靶核酸序列；所有媒介探针所包含的媒介子序列彼此不同；所有媒介探针所包含的靶核酸特异性结合序列彼此不同；所有媒介探针各自独立地标记有相同或不同的猝灭基团；所有信号探针各自独立地标记有相同或不同的报告基团。
8、优选地，还包含上游引物、下游引物、通用引物、核酸聚合酶、逆/反转录酶中的一项或几项的组合。
9、本专利技术提供了一种基于熔解曲线分析的核酸多重检测方法，采用上述探针组实现，具体包括以下步骤：针对待检测的每一种靶核酸序列，设计一种上游引物序列和一种媒介探针；将待测的n种靶核酸与上游引物和n种媒介探针进行核酸杂交，n为≥2的整数；核酸杂交完成后，上游引物延伸并对所述媒介探针进行切割，得到媒介子产物；将所述媒介子产物与m种信号探针接触并杂交后，进行熔解曲线分析，并根据熔解曲线分析的结果，确定所述n种靶核酸序列是否存在于所述样品中，m为≤n且＞0的整数。
10、进一步地，还包括将待测的n种靶核酸与上游引物、下游引物序列、通用引物和媒介探针进行核酸杂交；所述上游引物包含与所述靶核酸序列互补的序列；所述下游引物序列包含与所述靶核酸序列互补的序列；所述上游引物序列和下游引物序列在5'端具有一段相同的寡核苷酸序列。
11、进一步地，每一种所述信号探针至少对应两种媒介探针。
12、与现有技术相比，本专利技术的技术方案具有以下有益效果：
13、(1)当靶标存在时，切割释放的媒介子片段可与信号探针杂交，并在熔解分析阶段产生向上的熔解峰；无检测靶本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种探针组，包含一种信号探针和至少一种媒介探针，其特征在于：所述媒介探针从5 '至3 '方向包含媒介子序列和靶核酸特异性结合序列，所述媒介子序列包含不与靶核酸序列互补的序列；所述靶核酸特异性结合序列包含与靶核酸序列互补的序列和信号猝灭基团，所述信号猝灭基团位于靶核酸特异性结合序列区域；所有媒介探针包含的媒介子序列彼此不同，但均可与信号探针杂交；所述信号探针与每一种所述媒介子序列完全或部分互补；所述信号探针标记有报告基团和猝灭基团。
2.根据权利要求1所述探针组，其特征在于：所述猝灭基团修饰于媒介探针第5-140位碱基上。
3.根据权利要求1所述探针组，其特征在于：探针组内所有所述媒介探针包含的靶核酸特异性结合序列彼此不同；所述媒介探针中的靶核酸特异性结合序列的长度为10-100nt；所述媒介子序列的长度为5-100nt。
4.根据权利要求1所述探针组，其特征在于：所述信号探针为自猝灭探针，所述报告基团和猝灭基团相距大于或等于5-80nt。
5.一种试剂盒，其特征在于：包含至少一种权利要求1-4任意一项所述的探针组。
7.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于：还包含上游引物、下游引物、通用引物、核酸聚合酶、逆/反转录酶中的一项或几项的组合。
8.一种基于熔解曲线分析的核酸多重检测方法，其特征在于，采用权利要求1至4任意一项所述探针组实现，具体包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述基于熔解曲线分析的核酸多重检测方法，其特征在于：还包括将待测的n种靶核酸与上游引物、下游引物序列、通用引物和媒介探针进行核酸杂交；所述上游引物包含与所述靶核酸序列互补的序列；所述下游引物序列包含与所述靶核酸序列互补的序列；所述上游引物序列和下游引物序列在5 '端具有一段相同的寡核苷酸序列。
10.根据权利要求8所述基于熔解曲线分析的核酸多重检测方法，其特征在于：每一种所述信号探针至少对应两种媒介探针。
...【技术特征摘要】
1.一种探针组，包含一种信号探针和至少一种媒介探针，其特征在于：所述媒介探针从5 '至3 '方向包含媒介子序列和靶核酸特异性结合序列，所述媒介子序列包含不与靶核酸序列互补的序列；所述靶核酸特异性结合序列包含与靶核酸序列互补的序列和信号猝灭基团，所述信号猝灭基团位于靶核酸特异性结合序列区域；所有媒介探针包含的媒介子序列彼此不同，但均可与信号探针杂交；所述信号探针与每一种所述媒介子序列完全或部分互补；所述信号探针标记有报告基团和猝灭基团。
2.根据权利要求1所述探针组，其特征在于：所述猝灭基团修饰于媒介探针第5-140位碱基上。
3.根据权利要求1所述探针组，其特征在于：探针组内所有所述媒介探针包含的靶核酸特异性结合序列彼此不同；所述媒介探针中的靶核酸特异性结合序列的长度为10-100nt；所述媒介子序列的长度为5-100nt。
4.根据权利要求1所述探针组，其特征在于：所述信号探针为自猝灭探针，所述报告基团和猝灭基团相距大于或等于5-80nt。
5.一种试剂盒，其特征在于：包含至少一种权利要求1-4任意一项所述的探针组。
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【专利技术属性】
技术研发人员：左晨，陈剑，李俊杰，赵朝辉，谢国明，
申请(专利权)人：重庆创芯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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