使用CRISPR-CAS系统的多核苷酸扩增技术方案

本申请涉及使用CRISPR

【技术实现步骤摘要】
使用CRISPR
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CAS系统的多核苷酸扩增
[0001]本申请是申请日为2015年11月10日，申请号为201580072952.7，标题为“使用CRISPR
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CAS系统的多核苷酸扩增”的申请的分案申请。
[0002]本公开内容大体涉及用于扩增多核苷酸的方法，且更具体地涉及使用CRISPR
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Cas系统扩增多核苷酸的方法及其应用。
[0003]背景
[0004]核酸扩增为许多基于核酸的方法诸如核酸测序的关键步骤。目前，使用的大多数核酸扩增方法，例如在下一代测序中用于簇产生的那些，都需要温度循环和流体交换两者。在另一方面，等温扩增可以通过消除温度斜坡(temperature ramp)和平衡时间而是时间和能量有效的。已经开发了几种等温扩增方法，例如基于重组酶聚合酶扩增(RPA)的等温扩增。这些等温扩增系统通常缺乏理想地适于一些应用的期望的速度和效率。此外，一些系统要求另外的酶和试剂，包括ATP。因此，本领域对方便、快速和有效的等温核酸扩增方法仍存在需求。本公开内容通过提供使用CRISPR
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Cas系统扩增核酸的方法来解决该需求。还提供了相关优势。
[0005]成簇的规律间隔的短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)(CRISPR)牵涉许多细菌和古生菌(archaea)中保护细胞免受噬菌体和结合型质粒(conjugative plasmid)影响的干扰途径(Marraffini和Sontheimer,2010,Nat Rev Genet.11(3):181
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190)。CRISPR由通常起源于噬菌体或质粒DNA的相似尺寸的称作间隔子的独特可变DNA序列间隔的短重复序列的阵列组成(Barrangou等，2007,Science 315:1709
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12；Bolotin等，2005,Microbiology 151:2551
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61；Mojica等，2005,J Mol Evol 60:174
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82)。因此，CRISPR序列提供过去的感染的适应性遗传记录，并且可以被转录为CRISPR RNA(crRNA)
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靶向侵入性核酸的小RNA(Marraffini和Sontheimer,2010,Nat Rev Genet11(3):181
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190)。CRISPR通常与编码与CRISPR相关蛋白的CRISPR相关(Cas)基因缔合。Cas蛋白可以提供破坏被crRNA靶向的入侵外来核酸的机制。CRISPR连同Cas(CRISPR相关)基因一起构成提供针对细菌和古生菌的侵入性外来核酸的获得性耐受性的适应性免疫系统(Barrangou等，2007,Science315:1709
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12)。
[0006]概述
[0007]本公开内容提供了用于扩增多核苷酸的方法，且更具体地涉及使用CRISPR
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Cas系统扩增靶DNA序列的方法及其应用。
[0008]在一方面，本文提供了一种用于扩增靶双链核酸的方法，所述方法包括：(a)提供一种系统，所述系统具有：成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)RNA(crRNA)或其衍生物、以及CRISPR相关(Cas)蛋白或其变体，其中crRNA或其衍生物包含与靶双链核酸的第一链的区域互补的靶特异性核苷酸区域；(b)使靶双链核酸与系统接触以形成复合物；(c)使引物与靶双链核酸的第二链杂交，所述引物包含与靶双链核酸的第二链的区域互补的序列，以及(d)使用聚合酶从引物延伸与靶双链核酸的第二链互补的核酸。
[0009]在一些实施方案中，本文提供的方法还包括重复步骤(c)至步骤(d)一次或更多次，例如，直至达到期望的扩增程度。在一些实施方案中，本文提供的方法还包括重复步骤
(a)至步骤(d)直至达到期望的扩增程度。
[0010]在一些实施方案中，本文提供的靶核酸为双链DNA(dsDNA)。在一些实施方案中，靶核酸为双链RNA(dsRNA)。
[0011]在一些实施方案中，系统为I型CRISPR
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Cas系统或其衍生物。在一些实施方案中，系统为II型CRISPR
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Cas系统或其衍生物。在一些实施方案中，系统为III型CRISPR
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Cas系统或其衍生物。
[0012]在一些实施方案中，系统还包含反式激活crRNA(tracrRNA)或其衍生物。在一些实施方案中，crRNA或其衍生物为包含与tracrRNA多核苷酸融合的crRNA多核苷酸的多核苷酸。
[0013]在一些实施方案中，靶双链核酸的第一链包含与5
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NGG前间区(protospacer)相邻基序(PAM)互补的序列。
[0014]在一些实施方案中，靶双链核酸的第一链包含通用序列，并且其中crRNA或其衍生物包含与通用序列的区域互补的序列。在一些实施方案中，引物包含通用序列的区域的序列。
[0015]在一些实施方案中，通用序列具有SEQ ID No.3的序列。在一些实施方案中，crRNA包含SEQ ID No.7的序列。在一些实施方案中，通用序列具有SEQ ID No.5的序列。
[0016]在一些实施方案中，通用序列具有SEQ ID No.4的序列。在一些实施方案中，crRNA包含SEQ ID No.8的序列。在一些实施方案中，通用序列具有SEQ ID No.6的序列。
[0017]在一些实施方案中，Cas蛋白或其变体为Cas9蛋白或其变体。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含两个失活的核酸酶结构域。在一些实施方案中，两个失活的核酸酶结构域包含切割与crRNA互补的链的结构域中的第一突变以及切割与crRNA不互补的链的结构域中的第二突变。在一些实施方案中，第一突变为D10A，且第二突变为H840A。在一些实施方案中，Cas蛋白或其变体为级联(Cascade)蛋白或其变体。在一些实施方案中，Cas蛋白或其变体为Cas3蛋白或其变体。
[0018]在一些实施方案中，聚合酶为链置换聚合酶。在一些实施方案中，聚合酶选自由以下组成的组：Bst、Bsu和Phi29。
[0019]在一些实施方案中，本文提供的方法还包括：在靶核酸和包含转移链的至少一种转座子末端组合物经历转座反应的条件下，将至少一种转座酶和转座子末端组合物应用于包含靶核酸的样品以产生混合物，其中靶核酸被片段化以产生多个靶核酸片段，并将通用引物序列掺入到多个靶核酸片段的每一个中，其中crRNA或其衍生物包含与通用引物的区域互补的靶特异性核苷酸区域。
[0020]在一些实施方案中，通用引物通过PCR反应被掺入到多个靶核酸片段中。在一些实施方案中，通用引物具有与5
’‑
NGG前间区相邻基序(PAM)互补的序列。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于扩增靶双链核酸的方法，所述方法包括：(a)提供一种系统，所述系统具有：成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)RNA(crRNA)，以及成簇的规律间隔的短回文重复相关(Cas)蛋白，其中所述成簇的规律间隔的短回文重复RNA包含与所述靶双链核酸的第一链的区域互补的靶特异性核苷酸区域，其中所述系统为I型成簇的规律间隔的短回文重复
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成簇的规律间隔的短回文重复相关系统，并且所述系统还包含反式激活成簇的规律间隔的短回文重复RNA(tracrRNA)；(b)使所述靶双链核酸与所述系统接触以形成复合物；(c)使引物与所述靶双链核酸的第二链杂交，所述引物包含与所述靶双链核酸的第二链的区域互补的序列，以及(d)使用聚合酶从所述引物延伸与所述靶双链核酸的第二链互补的核酸。2.一种用于扩增靶双链核酸的方法，所述方法包括：(a)提供一种系统，所述系统具有：成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)RNA(crRNA)，以及成簇的规律间隔的短回文重复相关(Cas)蛋白，其中所述成簇的规律间隔的短回文重复RNA包含与所述靶双链核酸的第一链的区域互补的靶特异性核苷酸区域，其中所述系统为III型成簇的规律间隔的短回文重复
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成簇的规律间隔的短回文重复相关系统，并且所述系统还包含反式激活成簇的规律间隔的短回文重复RNA(tracrRNA)；(b)使所述靶双链核酸与所述系统接触以形成复合物；(c)使引物与所述靶双链核酸的第二链杂...

【专利技术属性】
技术研发人员：杰弗里，
申请(专利权)人：伊鲁米那股份有限公司，
类型：发明
国别省市：