一种草莓白粉病菌LAMP可视化快速检测方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种草莓白粉病菌LAMP可视化快速检测方法及应用，是以待检测样本的DNA为模板，利用引物进行LAMP反应扩增，再通过实时荧光扩增曲线和荧光染料目测观察法进行检测。引物包括1对外侧引物F3和B3，1对内侧引物FIP和BIP，以及1对环引物LF和LB。本发明专利技术的草莓白粉病菌LAMP引物特异性强、扩增效果好，建立了其快速、简便、特异性强、灵敏度高的草莓白粉病菌LAMP可视化检测体系，可用于草莓白粉病植株带菌组织及发病前期、初期田间带菌检测，并且该方法具有检测时间短、对操作人员要求低、肉眼直接观察结果，检测成本低等优点，对于草莓白粉病早期诊断、监测，提早预防、确定最佳防治时间具有重要的意义。治时间具有重要的意义。治时间具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】
一种草莓白粉病菌LAMP可视化快速检测方法及应用


[0001]本专利技术涉及草莓白粉病
，特别涉及一种草莓白粉病菌LAMP可视化快速检测方法及应用。

技术介绍

[0002]草莓白粉病是保护地草莓发病面积较大，发病频率较高的草莓病害之一，其病原菌是子囊菌亚门真菌羽衣草单囊壳菌(Sphaerotheca aphanis)，属于气传病害，主要危害草莓的叶片和果实，有时还会危害草莓的花梗和叶柄，匍匐茎上很少发生，草莓白粉病的发生贯穿草莓生长的各个阶段，多发于草莓生产旺季。草莓白粉菌属于专性寄生菌，在全世界各地都有分布，主要发生于气候条件相对寒冷的地区，我国较为寒冷的华北平原发病较为严重。草莓白粉病一直是制约我国草莓产业的一大瓶颈，近年来尤其是保护地草莓白粉病对草莓果实和植株产生极大影响，甚至在栽培条件良好的大棚内往往更容易发病，且一旦发病，整棚的草莓都可能感染，采摘时由于发病症状不明显，果实表面白粉菌数量太少，有些草莓虽然在采摘时没有发现染病情况，但也会在货架期间的两到三天出现白粉病，此时的草莓不宜出售。病果率超过50％，病叶率超过45％，草莓的品质变劣，果实表面失去光泽，草莓产量下降，给种植农户带来极大的经济损失。适宜采摘的“红颜”、“章姬”等品种对草莓白粉病较为敏感；防治技术不到位，农户单一频繁使用几种药剂，导致病菌抗药性较高。果实上的白粉病病原菌较叶片更难防治，于是生产上“保险药”频繁使用，草莓安全生产受到了威胁。
[0003]目前草莓白粉病最主要防治手段仍然是喷施化学农药，但随着施药量的增加，出现了果实品质下降、环境污染、病菌抗性产生等一系列问题。及时、准确预测白粉病的发生时期、流行强度，确定药剂使用时期、次数和剂量能够提高药效、减少施药次数、降低生产成本、减轻环境污染等因农药使用所带来的负面影响，为白粉病的综合防治提供依据。因此，开展草莓白粉病预测预报研究对于科学防治草莓白粉病具有重要的意义。目前，还没有草莓白粉病快速检测技术的报道，因此，建立高效、快速的早期检测技术将为草莓白粉病的科学防控提供新的思路，推动草莓产业的健康发展。
[0004]传统的白粉病早期检测方法往往根据病组织的症状、病原菌的特征以及研究人员的经验进行识别，但是白粉病引起的早期退绿与其他病原引起的症状相似，很难准确判断。另一方面，白粉病是专性寄生菌，不能进行人工培养，因此不能单靠传统的分离培养、血清鉴定和ELISA等方法进行检测难度较大。
[0005]环介导等温扩增(loop
‑
mediated isothermal amplification，LAMP)是2000年日本学者Notomi公开发表的一种新型核酸扩增技术，其能够识别靶序列上6个特异区域的4条正反向外引物和正反向内引物，在60
‑
65℃恒温条件下，利用高活性链置换DNA聚合酶，特异、高效地扩增靶基因。该技术的灵敏度是普通PCR的100倍，并且15
‑
60min即可实现目标基因高效扩增。LAMP反应产物不仅可以通过浊度仪、real
‑
time PCR仪及凝胶电泳仪进行检测，而且还可以通过SYBR GreenⅠ、钙黄绿素、羟基萘酚蓝染色后肉眼识别。由于LAMP反应简
单、快速、高效、经济，且无需特殊设备，检测结果可由肉眼判断，极适合于在基层生产部门推广应用，因而具有极为广泛的应用前景。目前LAMP检测主要应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测，在植物病原菌检测中报道较少，关于草莓白粉病菌的LAMP检测国内外均未见报道，因此开发一种针对草莓白粉病菌可视化LAMP检测技术，对于草莓白粉病早期诊断、病原菌鉴定，及时高效地控制草莓白粉病发生蔓延具有重要的应用价值。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种草莓白粉病菌LAMP可视化快速检测方法及应用，其克服了现有技术的上述缺陷。
[0007]本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
[0008]一种草莓白粉病菌LAMP可视化快速检测方法，所述检测方法中的引物包括1对外侧引物F3和B3，1对内侧引物FIP和BIP，以及1对环引物LF和LB，序列如下所示：
[0009]F3:5
’‑
CGGTATTCCGAGGGGCAT
‑3’
，
[0010]B3:5
’‑
CCTGATCCGAGGTCATCCAA
‑3’
，
[0011]FIP:5
’‑
CTGTTTAGGGGACGCCGAGCTGTTCGAGCGTCAGAACATC
‑3’
，
[0012]BIP:5
’‑
GGCGGTACCGTTGTGCTCTCTAGGTGGGTTTTGGCAGGT
‑3’
，LF:5
’‑
ACCAAGCCAGGCTTGAGAG
‑3’
，
[0013]LB:5
’‑
GTAGTCACGTATCTCGCGACAGAG
‑3’
。
[0014]优选地，上述技术方案中，包括以下步骤：以待检测样本的DNA为模板，利用所述引物进行LAMP反应扩增，再通过实时荧光扩增曲线和荧光染料目测观察法进行检测。
[0015]优选地，上述技术方案中，LAMP反应体系为：10
×
Isothermal Amplification Buffer2.5μL、8mmol/L的MgSO41.5μL、1.6mmol/LdNTPs4.0μL、1.2mmol/L甜菜碱0.6μL、320u/mLBstDNA聚合酶1μL，DNA模板，钙黄绿素、1.6μM的FIP和BIP各1μL，0.2μMF3和B3各1μL，0.4μM LoopF和LoopB各1μL，无菌去离子水补足25μL。
[0016]优选地，上述技术方案中，所述实时荧光扩增曲线为：收集到荧光信号，扩增曲线呈“S”型为阳性，未收集到扩增荧光信号的呈直线型为阴性。
[0017]优选地，上述技术方案中，荧光染料目测观察法：在LAMP反应体系中加入1μL钙黄绿素荧光染料，反应结束后，肉眼观察反应液呈绿色荧光的为阳性，显橙色的为阴性。
[0018]优选地，上述技术方案中，LAMP反应条件：65℃温育60min，间隔1min读取荧光，之后80℃下灭活5min，结束反应。
[0019]一种草莓白粉病菌LAMP可视化快速检测方法在草莓白粉病菌诊断、监测和鉴定中的应用。
[0020]一种草莓白粉病菌LAMP可视化快速检测方法在在草莓白粉病植株带菌组织及发病前期、初期田间带菌检测中的应用。
[0021]一种草莓白粉病菌LAMP可视化快速检测方法在转基因草莓及其加工后产品的快速检测中的应用。
[0022]本专利技术上述技术方案，具有如下有益效果：
[0023]本专利技术提供的草莓白粉病菌LAMP引物特异性强、扩增效果好，并建立本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种草莓白粉病菌LAMP可视化快速检测方法，其特征在于，所述检测方法中的引物包括1对外侧引物F3和B3，1对内侧引物FIP和BIP，以及1对环引物LF和LB，序列如下所示：F3:5
’‑
CGGTATTCCGAGGGGCAT
‑3’
，B3:5
’‑
CCTGATCCGAGGTCATCCAA
‑3’
，FIP:5
’‑
CTGTTTAGGGGACGCCGAGCTGTTCGAGCGTCAGAACATC
‑3’
，BIP:5
’‑
GGCGGTACCGTTGTGCTCTCTAGGTGGGTTTTGGCAGGT
‑3’
，LF:5
’‑
ACCAAGCCAGGCTTGAGAG
‑3’
，LB:5
’‑
GTAGTCACGTATCTCGCGACAGAG
‑3’
。2.根据权利要求1所述的草莓白粉病菌LAMP可视化快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：以待检测样本的DNA为模板，利用所述引物进行LAMP反应扩增，再通过实时荧光扩增曲线和/或荧光染料目测观察法进行检测。3.根据权利要求2所述的草莓白粉病菌LAMP可视化快速检测方法，其特征在于，LAMP反应体系为：10
×
Isothermal Amplification Buffer2.5μL...

【专利技术属性】
技术研发人员：贲海燕，郝永娟，姚玉荣，霍建飞，王万立，刘晓琳，
申请(专利权)人：天津市农业科学院，
类型：发明
国别省市：