唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP检测引物组、试剂盒以及冻干微球的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP检测引物组、试剂盒以及冻干微球的制备方法，属于核酸检测领域。该检测引物组针对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的16S～23S rRNA保守序列设计，检测引物组包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB。包含这种检测引物组的冻干微球的制备方法包括：将上述检测引物组与LAMP反应基液混合，得到扩增反应体系；将扩增反应体系与冻干保护剂混合，逐滴滴入液氮中速冻成球后，冷冻干燥。这种检测方法，利用上述冻干微球，能够简单、高效的检测出唐菖蒲伯克霍尔德氏菌存在与否，进而判断出检测样本中是否含有米酵菌酸毒素，特异性强，不易出现假阳性。不易出现假阳性。不易出现假阳性。

【技术实现步骤摘要】
唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP检测引物组、试剂盒以及冻干微球的制备方法


[0001]本专利技术属于基因检测
，具体涉及一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP检测引物组、试剂盒以及冻干微球的制备方法。

技术介绍

[0002]唐菖蒲伯克霍尔德氏菌为革兰氏阴性短杆菌、两端钝圆，无牙孢，有鞭毛，在自然界分布广泛。唐菖蒲伯克霍尔德氏菌为兼性厌氧，易在食品表面生长。唐菖蒲伯克霍尔德氏菌可以产生米酵菌酸引起食物中毒，唐菖蒲伯克霍尔德氏菌不耐高温，很容易被高温杀死，但是它所产生的“米酵菌酸”毒素耐热，一般烹调方法不能破坏其毒性。由于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌食物中毒流行规模较大、发病率和病死率极高，而且目前缺乏特效的解毒措施。因此唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的检测方法是否灵敏、快速至关重要。
[0003]目前米酵菌酸的检测方法的依据是GB 5009.189
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2016《食品安全国家标准食品中米酵菌酸的测定》，用的是高相液相色谱法检测，检测的仪器及试剂成本非常相对较高，除此以外也有用薄层层析、紫外分光光度、ELISA、胶体金试纸条等方法检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌所产生的外毒素的。这些方法虽然操作相对简单一些，但很容易出现假阳性现象。
[0004]环介导恒温扩增技术是一种不需要精确控温过程的基因诊断技术，借助6条特异性引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，可在等温条件下快速，高特异性和灵敏的扩增靶序列，检测全过程只需要在60
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65℃条件下扩增40
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60min，具有操作简单、反应时间短、特异性高、灵敏度高等特点，广泛应用于病原菌检测领域。
[0005]环介导恒温扩增法结果判读方法主要有1：浊度法，可通过反应后肉眼观察是否存在白色絮状沉淀，判定检测结果，主观因素较强，灵敏度低。2、显色法，反应结束后加入核酸染料SYBR GREEN、HNB、钙黄绿素等，在紫外灯或肉眼条件下显示不同的颜色，结果判定简单，但需要反应结束后开盖，极易造成气溶胶污染。3、荧光检测法，该方法通过向反应体系中加入荧光染料SYBR GREEN，通过荧光PCR仪可实时观察体系中荧光变化，生成荧光曲线，通过曲线观察扩增结果，该方法闭管检测，杜绝气溶胶污染，但因SYBR GREEN染料特性，能和任意的双链DNA结合，并发生荧光，特异性低易出现假阳性。

技术实现思路

[0006]本专利技术的第一目的在于提供一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP检测引物组，该引物组针对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的保守序列16S～23S rRNA设计，能够特异性的识别唐菖蒲伯克霍尔德氏菌，特异性强。
[0007]本专利技术的第二目的在于提供一种用于检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的冻干微球的制备方法，该方法采用冻干预混液的方式，将所有的试剂包含在一个冻干微球中，制备过程简单，冻干微球中试剂的稳定性好。
[0008]本专利技术的第三目的在于提供一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP检测试剂盒，该试
剂盒利用上述冻干微球，能够简单、快速、高效的检测出唐菖蒲伯克霍尔德氏菌存在与否，进而判断出检测样本中是否含有米酵菌酸毒素，特异性强，不易出现假阳性。
[0009]本专利技术的第四目的在于提供一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP检测方法，该检测方法仅需将上述冻干微球复溶后与模板DNA混合扩增，即可完成检测，方法简便，特异性强，能够有效避免传统检测过程中加样的繁琐过程以及加样过程中导致试剂污染、假阳性等结果。
[0010]本专利技术通过以下技术方案实现：
[0011]第一方面，本专利技术提供一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP检测引物组，检测引物组针对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的16S～23S rRNA保守序列设计，检测引物组包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB；
[0012]外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
[0013]外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
[0014]内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
[0015]内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
[0016]环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
[0017]环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0018]进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，上述外引物F3和外引物B3的浓度均为0.15～0.25μM，内引物FIP与内引物BIP的浓度均为1.5～1.7μM，环引物LF和环引物LB的浓度为0.4～0.8μM。
[0019]第二方面，本申请提供一种用于检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的冻干微球的制备方法，其包括：
[0020]将上述检测引物组与LAMP反应基液混合，得到扩增反应体系；
[0021]将扩增反应体系与冻干保护剂混合，逐滴滴入液氮中速冻成球后，冷冻干燥。
[0022]进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，上述冷冻干燥的步骤包括：将在液氮中形成的微球于﹣50～60℃下进行第一次干燥8～16h后，在20～30℃下进行二次升华干燥4～10h。
[0023]优选地，上述冷冻干燥的步骤包括：将在液氮中形成的微球于
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50～60℃下进行第一次干燥10h后，在20～30℃下进行二次升华干燥6h。
[0024]进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，上述冻干保护剂包括海藻糖、PEG20000和甘氨酸中的至少一种。
[0025]进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，上述冻干保护剂是通过质量分数为65～75％的海藻糖、质量分数为6～10％的甘氨酸以及质量分数为20～30％的PEG20000按照体积比2:3:6混合所得。
[0026]进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，上述LAMP反应基液包括：DNA聚合酶、dNTPs、MgSO4、显色剂、甜菜碱、pH调节剂、ddH2O和buffer。
[0027]进一步地，在本专利技术较佳的实施例中，上述显色剂为酚红、甲酚或中性红。
[0028]第三方面，本申请提供一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP检测试剂盒，试剂盒包括上述制备方法制得的冻干微球。
[0029]第四方面，本申请提供一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP检测方法，其利用上述检测试剂盒进行检测，包括：
rRNA，以此为靶点基因，运用在线引物设计软件(https://primerexplorer.jp/lamp3.0.0/index.html)设计LAMP引物，进行分析和优化后，最终确定的引物序列如表1所示：
[0047]表1.检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP引物序列
[0048][0049]实施例2
[0050]本实施例提供一种用于检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的冻干微球，其制备方法包括：
[0051](1)制备冻干保护剂：取70％海藻糖、8％的苏氨酸、25％的PEG20000按照体积比2:3:6混合，得到冻干保护剂。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP检测引物组，其特征在于，所述检测引物组针对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的16S～23S rRNA保守序列设计，所述检测引物组包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB；所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。2.根据权利要求1所述的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP检测引物组，其特征在于，所述外引物F3和所述外引物B3的浓度均为0.15～0.25μM，所述内引物FIP与所述内引物BIP的浓度均为1.5～1.7μM，所述环引物LF和环引物LB的浓度为0.4～0.8μM。3.一种用于检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的冻干微球的制备方法，其特征在于，其包括：将如权利要求1或2所述的检测引物组与LAMP反应基液混合，得到扩增反应体系；将所述扩增反应体系与冻干保护剂混合，逐滴滴入液氮中，控制每个液滴的体积为23～28μL，速冻成球后，冷冻干燥。4.根据权利要求3所述的冻干微球的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥的步骤包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：许世伟，许远，邵俊影，吴镇宇，王欣，林圣博，
申请(专利权)人：河南中检食安生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：