一种DeepVent(exo-)DNA聚合酶的测定组合物及测定方法技术

本发明专利技术公开了一种Deep Vent(exo

【技术实现步骤摘要】
一种Deep Vent(exo
‑
)DNA聚合酶的测定组合物及测定方法


[0001]本专利技术涉及DNA聚合酶
，具体为Deep Vent(exo
‑
)DNA聚合酶的酶活检测方法。

技术介绍

[0002]Deep Vent(exo
‑
)DNA Polymerase是通过基因工程方法，对Deep Vent DNA Polymerase 进行了改造，使其缺失了3
′‑5′
核酸外切酶(校正)活性。Deep Vent(exo
‑
)DNA Polymerase 在95℃半衰期约为23h，在100℃半衰期为8h，所以在95
‑
100℃仍可表现的非常稳定，具有极高的热稳定性。Deep Vent(exo
‑
)DNA Polymerase主要用于PCR反应或高温(72℃) DNA测序。
[0003]目前还没用统一的酶活测定方法，导致各个生产企业只能依据本公司内部企业标准来定义酶活，导致下游IVD原料筛选时，对于不同公司的酶活之间没有可比性。基于目前的现状，酶活测定方法研发就迫在眉睫。

技术实现思路

[0004]基于上述情况，我们公开了一种Deep Vent(exo
‑
)DNA聚合酶的酶活检测方法。解决上述技术问题。
[0005]常规方法通过PCR扩增的方式，通过连续梯度倍比稀释样品，来粗略测定Deep Vent (exo
‑
)DNA Polymerase的酶活，检测方法偏差在50％左右；
[0006]本专利技术通过等温延伸相对测活的方式，采用多条引物，高灵敏度，精准绝对定量，而非PCR扩增的方式，通过建立标准曲线，来精准的测定Deep Vent(exo
‑
)DNA Polymerase 的酶活，检测方法偏差在10％以内。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：
[0008]本专利技术的技术原理如下：
[0009]通过等温延伸实验，使用多条引物和模板结合，通过检测酶活力浓度，用对照酶的信号增加值和酶量作标准曲线，计算待测酶活力浓度。基于双链DNA结合染料能特异嵌入双链DNA发出荧光的原理，开发了一种实时监测DNA聚合酶活性的简便方法。在检测过程中，聚合酶的聚合反应进程被实时转换为荧光信号，通过监测荧光强度的变化实验时检测聚合酶的活性及药物对聚合酶活性的影响，该方法不需要对DNA进行放射性同位素标记和荧光标记，也不需要聚丙烯酰胺电泳和聚合酶链式反应，是一种简便、快速的聚合酶活性实时监测新方法，为研究抗体肿瘤药物对聚合酶活性的影响提供了一种简捷方法，也将为相关疾病诊治和药物筛选提供一种新的思路。
[0010]与现有技术相比，本专利技术所达到的有益效果是：
[0011]1、通过等温延伸相对测活的方式，而非PCR扩增的方式，通过建立标准曲线，来精准的测定Deep Vent(exo
‑
)DNA Polymerase的酶活，方法偏差在10％以内，检测时间在 10
‑
30min，检测时间短。
[0012]2、不需要对DNA进行放射性同位素标记和荧光标记，也不需要聚丙烯酰胺电泳和聚合酶链式反应，操作简单方便；
[0013]3、本专利技术以Deep Vent(exo
‑
)酶为标样，采用等温延伸的方法；建立酶活测试的标准曲线，可以实现R2＞0.98，批内差＜10％，批间差＜10％，偏差＜10％；
[0014]4、本专利技术适用性广，可以检测普通的Deep Vent(exo
‑
)及突变体、热启动DeepVent(exo
‑
)酶及突变体。
附图说明
[0015]附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：
[0016]图1是实例一通过PCR方式定活力浓度方法建立实验结果图一；
[0017]图2是实例一通过PCR方式定活力浓度方法建立实验结果图二；
[0018]图3是实例一通过PCR方式定活力浓度方法建立实验结果图三；
[0019]图4是实例二通过PCR方式测定待测样品活力浓度实验结果图一；
[0020]图5是实例二通过PCR方式测定待测样品活力浓度实验结果图二；
[0021]图6是实例三Deep Vent酶的酶活再验证6.实验结果PCR电泳图一；
[0022]图7是实例三Deep Vent酶的酶活再验证6.实验结果PCR电泳图二；
[0023]图8是实例四实验结果：荧光图谱(2294引物+M13ssDNA(200ng/uL)；
[0024]图9是实例四实验结果：荧光图谱(6448引物+M13ssDNA(200ng/uL)；
[0025]图10是实例四标准曲线2294引物+M13ssDNA(200ng/uL)图；
[0026]图11是实例四标准曲线6448引物+M13ssDNA(200ng/uL)图；
[0027]图12是实例五实验结果：图谱(2294引物+M13mp18ssDNA(250ng/uL)；
[0028]图13是实例五实验结果：图谱(6448引物+M13mp18ssDNA(250ng/uL)；
[0029]图14是实例五标准曲线2294引物+M13mp18ssDNA(250ng/uL)图；
[0030]图15是实例五标准曲线6448引物+M13mp18ssDNA(250ng/uL)图；
[0031]图16是实例六实验结果：荧光图谱；
[0032]图17是实例六标准曲线图；
[0033]图18是实例七实验结果：荧光图谱；
[0034]图19是实例七标准曲线图；
[0035]图20是实例八实验结果对照酶AK2501图谱；
[0036]图21是实例八实验结果待测酶BC2001图谱；
[0037]图22是实例八标准曲线图。
具体实施方式
[0038]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0039]模板和引物序列对应表：
[0040]序号模板或序列名称对应序列表1λDNASEQ ID NO.12λDNA
‑
3FSEQ ID NO.23λDNA
‑
3RSEQ ID NO.34λDNA为模板，λDNA
‑
3 Primer对应产物SEQ ID NO.45λDNA
‑
qF4SEQ ID NO.56λDNA
‑
qR4SE本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Deep Vent(exo
‑
)DNA聚合酶的测定组合物，其特征在于，包括如下组分：组分终浓度10
×
Thermo反应缓冲液1
×
MgCl25mMSYBRGreen1.6
×
DNA模板10ng/uLdNTPMix0.2mM每种引物Mix0.4uMNF水/所述Thermo pol反应缓冲液具体成分如下，试剂终浓度去RNA酶水/Tris8.820mMKCl10mM(NH4)2SO410mMDTT1mMEDTA0.1mMCA
630
0.050％Tween200.050％BSA0.1mg/ml所述DNA模板为M13ssDNA或M13mp18ssDNA，所述M13ssDNA如SEQ ID NO.11所示，所述M13mp18ssDNA序列如SEQ ID NO.12所示；所述引物序列包括：2294引物、3248引物、5127引物和6448引物，所述2294引物序列如SEQ ID NO.7所示，所述3248引物序列如SEQ ID NO.8所示，所述5127引物序列如SEQ ID NO.9所示，所述6448引物序列如SEQ ID NO.10所示。2.根据权利要求1所述的一种Deep Vent(exo<...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴宁，张惠丹，
申请(专利权)人：苏州译酶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：