一种检测人HLA-I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术属于基因测序领域，涉及一种检测人HLA

【技术实现步骤摘要】
一种检测人HLA
‑
I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒及其使用方法


[0001]本专利技术属于基因测序领域，具体涉及一种检测人HLA
‑
I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒及其使用方法。

技术介绍

[0002]测序法已经成为一种常规的实验技术，最近新一代测序技术的显著优势，主要有以下几种：大规模平行签名测序（Massively Parallel Signature Sequencing，MPSS)、高通量测序技术、聚合酶克隆（Polony Sequencing）、454焦磷酸测序（454 pyrosequencing）、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、离子半导体测序（Ion semiconductor sequencing）、DNA纳米球测序（DNA nanoball sequencing）等。
[0003]主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）是一组编码动物主要组织相容性抗原的基因群的统称。1958年Dausset等发现，多次接受输血的患者、多产妇和用同种白细胞免疫的志愿者血清中，存在不同特异性的白细胞抗体，用这些抗体鉴定出许多不同特异性的白细胞抗原，称为人类白细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）。通过家系和人群遗传分析发现，人类MHC位于第6号染色体上，称为HLA复合体。MHC可以分为经典MHC与非经典MHC两类，经典MHC包括MHC
ꢀⅠ
、MHC
ꢀⅡ
、MHC
ꢀⅢ
基因，分别编码MHC
ꢀⅠ
分子、MHC
ꢀⅡ
分子、MHC
ꢀⅢ
分子。
[0004]MHC class
ꢀⅠ
（MHC
ꢀⅠ
）：位于一般细胞表面上，可以提供一般细胞内的一些状况，比如该细胞遭受病毒感染，则将病毒外膜碎片之氨基酸链（peptide）透过MHC提示在细胞外侧，可以供杀手CD8+ T细胞等辨识，以进行扑杀。Ⅰ类基因区包括HLA
‑
A、B、C位点的等位基因，编码HLA
‑
A抗原、B抗原和C抗原等经典的Ⅰ类抗原（分子）。
[0005]MHC class
ꢀⅡ
（MHC
ꢀⅡ
）：大多位于抗原提呈细胞（APC)上，如巨噬细胞等。这类提供则是细胞外部的情况，像是组织中有细菌侵入，则巨噬细胞进行吞食后，把细菌碎片利用MHC提示给辅助T细胞，启动免疫反应。Ⅱ类基因区十分复杂，主要包括HLA
‑
DP、DQ、DR三个亚区和新近确定的DN、DO、DM等3个亚区。
[0006]MHC class
ꢀⅢꢀ
(MHC
ꢀⅢ
) ：主要编码补体成分，肿瘤坏死因子（TNF），热休克蛋白70（HSP70)和21羟化酶基因（CYP21A和CYP21B)。Ⅲ类基因区内已定位的至少有36个基因，其中与免疫系统有关的基因有C4B、C4A、C2、Bf、肿瘤坏死因子（TNFA、TNFB）和热休克蛋白70(HSP70），分别编码C4、C2、B因子、TNF
‑
α、TNF
‑
β和HSP70分子。
[0007]针对MHC的研究，目前主要集中在针对bulk MHC的I类和II类两个方面。然而，查阅相关试剂盒，仅发现能够检测MHC的某一部分试剂盒，例如专利CN101892317B中描述的I类A基因的2
‑
4外显子、B基因的2
‑
4外显子和DRB1基因的2号外显子；专利CN105039332B描述的I类A、B、C三个基因的全长。结合大量文献研究，HLA的I类基因多态性显著，在1
‑
7号外显子上都显示出基因的多态性；II类集中在DRB1、DRA1、DPA1、DPB1、DQA1、DQB1六个基因的2
‑
4号外显子。目前，尚未发现有此类高范围bulk MHC转录本的试剂盒的出现。

技术实现思路

[0008]针对上述情况，本专利技术在转录组水平上，靶向HLA的I类主要集中在A、B、C三个基因的1
‑
6号外显子，II类集中在DRB1、DRA1、DPA1、DPB1、DQA1、DQB1六个基因的1
‑
4号外显子，开发出一种检测人HLA
‑
I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒及其使用方法。该试剂盒不仅能够高分辨率第全面检测人HLA的相关基因，并且能够精准区分细胞中HLA多态情况，具有十分重要的应用价值。
[0009]为实现以上目的，本专利技术具体方案如下：一种检测人HLA
‑
I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒，包括以下组分的试剂：（a）用于cDNA合成的逆转录试剂；（b）用于HLA
‑
I/II类基因捕获的HLA Target Mix1；（c）用于HLA
‑
I/II类基因捕获的HLA Target Mix2；（d）用于HLA
‑
I/II类基因捕获的PCR试剂；（e）用于捕获后DNA文库构建的试剂。
[0010]进一步的，所述逆转录试剂（a）包含逆转录酶、TSO引物、Poly d(T)引物、Buffer。
[0011]更进一步的，所述逆转录试剂（a）在逆转录的同时具有Template Switch的功能，能够在cDNA的5
’
端加上通用的序列。
[0012]本专利技术中，具有Template Switch功能的逆转录酶可选自TransScript
®ꢀ
IV Reverse Transcriptase、TransScript
®ꢀ
II Reverse Transcriptase、Vazyme HiScript
®ꢀ
Reverse Transcriptase、Vazyme HiScript
®ꢀ
II Reverse Transcriptase、Vazyme HiScript
®ꢀ
III Reverse Transcriptase、Vazyme M
‑
MLV(H
‑
) Reverse Transcriptase、ABclonal
®ꢀ
ABScript II Reverse Transcriptase、ABclonal
®ꢀ
ABScript III Reverse Transcriptase、Yeasen Hifair
®ꢀ
V Reverse Transcriptase、Invitrogen SuperScript
®ꢀ
IV Reverse Trascriptase，但不限于以上几种酶，事本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测人HLA
‑
I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒，其特征在于，包含以下组分的试剂：（a）用于cDNA合成的逆转录试剂；（b）用于HLA
‑
I/II类基因捕获的HLA Target Mix1；（c）用于HLA
‑
I/II类基因捕获的HLA Target Mix2；（d）用于HLA
‑
I/II类基因捕获的PCR试剂；（e）用于捕获后DNA文库构建的试剂。2.根据权利要求1所述的检测人HLA
‑
I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒，其特征在于，所述逆转录试剂（a）包含逆转录酶、TSO引物、Poly d(T)引物、Buffer。3.根据权利要求2所述的检测人HLA
‑
I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒，其特征在于，所述逆转录试剂（a）中的逆转录酶具有Template Switch的功能，能够在cDNA的5
’
端加上通用的序列；所述具有Template Switch功能的逆转录酶可选自TransScript
®ꢀ
IV Reverse Transcriptase、TransScript
®ꢀ
II Reverse Transcriptase、Vazyme HiScript
®ꢀ
Reverse Transcriptase、Vazyme HiScript
®ꢀ
II Reverse Transcriptase、Vazyme HiScript
®ꢀ
III Reverse Transcriptase、Vazyme M
‑
MLV(H
‑
) Reverse Transcriptase、ABclonal
®ꢀ
ABScript II Reverse Transcriptase、ABclonal
®ꢀ
ABScript III Reverse Transcriptase、Yeasen Hifair
®ꢀ
V Reverse Transcriptase、Invitrogen SuperScript
®ꢀ
IV Reverse Trascriptase。4.根据权利要求2所述的检测人HLA
‑
I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒，其特征在于，所述TSO引物由已知的Oligo和其3`端用于模板转换的1到多个碱基组成。5.根据权利要求4所述的检测人HLA
‑
I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒，其特征在于，所述已知的Oligo和3`端用于模板转换的碱基之间，还可以添加任意长度的碱基序列。6.根据权利要求2所述的检测人HLA
‑
I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒，其特征在于，所述Poly d(T)引物由Oligo d(T)
10
‑
29
序列和其5
’
端一段已知序列组成。7.根据权利要求1所述的检测人HLA
‑
I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒，其特征在于，所述组成试剂（b）HLA Target Mix1由5
’
read 1引物、靶向HLA
‑
I的A、B、C基因的7号外显子的引物、HLA
‑
II的DRB1、DRA1、DPA1、DPB1、DQA1、DQB1基因4号外显子的引物组成。8.根据权利要求1所述的检测人HLA
‑
I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒，其特征在于，所述组成试剂（c）HLA Target Mix2由5
’
read 1引物、靶向HLA
‑
I的A、B、C基因的6或7号外显子的引物、靶向HLA
‑
II的DRB1、DRA1、DPA1、DPB1、DQA1、DQB1基因4号外显子区域的引物组成；所述HLA Target Mix2中HLA
‑
II的靶向引物结合位点位于HLA Target Mix1中HLA
‑
II的靶向引物的内侧。9.根据权利要求7所述的检测人HLA
‑
I/II类基因表达分析和表达量的试剂盒，其特征在于，所述HLA Target Mix1的HLA
‑
I的A、B、C基因的上游引物HLA
‑
I Target Mix1
‑
F为：5
’‑
CAGACGCCGAGGATGGCC
‑3’
；所述HLA Target Mix1的HLA
‑
I的A、B、C基因的下游引物HLA
‑
I Target Mix1
‑
R为：5
’‑
CAGAGCCCTGGGCACTGT
‑3’
；所述HLA Target Mix1的HLA
‑
II的DRB、DRA、DPA、DPB、DQA、DQB基因的上游引物HLA
‑
II Target Mix1
‑
F为：DPA
‑
1：5
’‑
ATGCGCCCTGAAGACAGAATGT
‑3’
；DPB
‑
1：5
’‑
ATGATGGTTCTGCAGGTTTCTGC
‑3’
；DQA
‑
1：5
’‑
ATGATCCTAAACAAAGCTCTG
‑3’
；DQB
‑
1：5
’‑
GAARAAGKCTTTGCGGATCCC
‑
3`；DRA
‑
1：5
’‑
ATGGCCATAAGTGGAGTCCC
‑3’
；DRB
‑
1：5
’‑
GTGCTGAGCTCCCSACTGG
‑3’
；所述HLA Target Mix1的HLA
‑
II的DRB、DRA、DPA、DPB、DQA、DQB基因的下游引物HLA
‑
II Target Mix1
‑
R为：DPA
‑
1：5
’‑
TTATGATGAGGACGGTGCCC
‑3’
；DPB
‑
1：5
’‑
ATGAAGATGCCCACTCCACA
‑3’
；DQA
‑
1：5
’‑
CCTTCCAGGATGGGATTCACAAT
‑3’
；DQB
‑
1：5
’‑
GATGATAAGGCCCAGCCCAA
‑3’
；DRA
‑
1：5
’‑
GCTTTTGCGCAATCCCTTGAT
‑3’
；DRB
‑
1：5
’‑
TCCTGAAGTAGATGA...

【专利技术属性】
技术研发人员：矫士平，彭澄，
申请(专利权)人：科士华南京生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：