一种快速定量ssDNA丝状噬菌体的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种快速定量ssDNA丝状噬菌体的方法及其应用。本发明专利技术通过采用双层琼脂平板法和qPCR的方法结合，建立以Pf4和Pf6单链丝状噬菌体每个稀释梯度下的qPCR测定得到的Ct值(Y轴)与每个稀释梯度下Pf4和Pf6单链丝状噬菌体的数量(X轴)的标准曲线。通过双层琼脂平板法和qPCR测定的方法结合可以快速高效地对丝状噬菌体ssDNA的基因组进行定量，还可以对两个同时释放的ssDNA丝状噬菌体进行分别定量和比较。和比较。和比较。

【技术实现步骤摘要】
一种快速定量ssDNA丝状噬菌体的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种快速定量ssDNA丝状噬菌体的方法及其应用。

技术介绍

[0002]噬菌体是侵染细菌的病毒，它们是介导微生物基因水平转移的重要方式之一，是推动细菌基因组进化的原动力之一。噬菌体在分子生物学、抗菌制剂和噬菌体展示等方面得到广泛应用，噬菌体治疗最近成为多重耐药菌治疗的热门方法之一。温和性噬菌体进入细菌后，先“潜伏”下来，与宿主的复制步调保持一致。当收到外界传来的特定信号(如抗生素、紫外线等)，这些潜伏者就会被唤醒，毫不犹豫地“冲”出宿主细胞，导致宿主细菌死亡。这些激活的温和噬菌体携带的遗传物质包括单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)，单链RNA和双链RNA，其中噬菌体基因组大部分为dsDNA。丝状噬菌体发现于半个世纪以前，是目前已知最简单的生物实体之一，其基因组大小约为7
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12kb，为ssDNA。
[0003]由于噬菌体侵染细菌的过程中会造成细菌的裂解，抑制细菌的生长，会在含有特异宿主细菌的琼脂平板上出现噬菌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速定量ssDNA丝状噬菌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将铜绿假单胞菌菌液注入微流控装置的医用硅胶管中，静置，使细菌吸附在硅胶管内壁，启动微流控装置，以M9培养基在室温下进行细菌的生物膜培养，收集流出液，用微孔滤膜过滤，得到无菌的噬菌体液；(2)构建同时敲除Pf4和Pf6噬菌体基因的铜绿假单胞菌ΔPf4
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Pf6，将铜绿假单胞菌ΔPf4
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Pf6菌液与R
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top培养基混合后平铺于LB平板；以步骤(1)得到的噬菌体液作为原液，进行梯度稀释，将原液和稀释液分别点板于LB平板上，过夜培养，根据噬菌斑统计原液和稀释液中的噬菌体总数量；(3)分别往噬菌体原液和稀释液中加入DNase I和RNase I进行处理，然后以引物对pfkA
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F/pfkA
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R、pfiA
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F/pfiA
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R对经DNase I和RNase I处理后的噬菌体原液和稀释液进行qPCR检测，测定噬菌体原液和稀释液中Pf4和Pf6噬菌体的Ct值；(4)根据步骤(2)测得的噬菌体总数量，以及由步骤(3)测得的Pf4和Pf6噬菌体的Ct值计算得到的Pf4和Pf6的比例，确定噬菌体原液和稀释液中Pf4和Pf6噬菌体各自的数量；(5)以Pf4或Pf6噬菌体每个稀释浓度下测得的Ct值为纵坐标，每个稀释浓度下测得的噬菌体数量为横坐标，建立标准曲线，根据qPCR测定的Ct值得到对应单个类型丝状噬菌体的数量。2.根据权利要求1所述的快速定量ssDNA丝状噬菌体的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的M9培养基的配方为：每升培养基含47.8mM Na2HPO4、22mM KH2PO4、6.8mM NH4Cl、18.7mM NaCl、100μM CaCl2、2mM MgSO4、0.1％葡萄糖，余量为水。3.根据权利要求1所述的快速定量ssDNA丝状噬菌体的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的铜绿假单胞菌菌液的OD
600
＝1，所述的静置是静置1h；所述的微流控装置的流速为0.1mL/min。4.根据权利要求1所述的快速定量ssDNA丝状噬菌体的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述铜绿假单胞菌ΔPf4
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Pf6的构建步骤为：S1：通过PCR从铜绿假单胞菌PAO1基因组DNA中扩增出Pf4的上下游区域，扩增Pf4上游基因引物ΔPf4
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F1：5'
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GCCCCCGAGCTCGTTATTGGTCGTGGTTGCTTCCC
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3'和ΔPf4
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R1：5'
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GCCCCCGCTAGCGATCCCAATGCAAAAGCCCC
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3'，扩增Pf4下游基因引物ΔPf4
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F2：5'
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GCCCCCGCTAGCTGGAGCGGGCGAAGGGAATCGAACCCTCG
‑
3'和ΔPf4
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R2：5'
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GCCCCCAAGTTCAGCCTGGACGAGCACGAATACC
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3'；通过PCR从质粒pPS856中扩增出庆大霉素抗性基因盒，扩增庆大霉素抗性基因盒引物pEX18Gm
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F：5'
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AATCTTCTCTCATCCGCCAAAACA
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3'和pEX18Gm
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R：5'
‑
CGCCCAATACGCAAACCGCCTCTC
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3'；然后用ClonExpress II一步克隆试剂盒将这三个扩增片段连接到自杀质粒pEX18Ap中；...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓雪，郭云学，林兼仲，汤开浩，高欣宇，古嘉瑜，
申请(专利权)人：中国科学院南海海洋研究所，
类型：发明
国别省市：