一种寡核苷酸类药物的定量分析方法技术

本公开提供了一种寡核苷酸类药物的定量分析方法。所述定量分析方法包括：制备第一探针和第二探针；制备正向引物和反向引物；利用不同浓度的标准品绘制标准曲线；将寡核苷酸类药物与第一探针和第二探针进行退火反应和连接反应，得到待测连接产物；将待测连接产物利用正向引物和反向引物进行扩增反应，得到待检测的寡核苷酸类药物的Ct值；将待检测的所述寡核苷酸类药物的Ct值带入所述标准曲线，计算出待检测的所述寡核苷酸类药物的浓度。该方法无需对生物样本进行预处理，从而缩短了定量分析的时间，这大大提高了定量分析的效率。这大大提高了定量分析的效率。这大大提高了定量分析的效率。

【技术实现步骤摘要】
一种寡核苷酸类药物的定量分析方法


[0001]本公开涉及生物
，特别涉及一种寡核苷酸类药物的定量分析方法。

技术介绍

[0002]核酸药物是继小分子药物、蛋白药物和抗体药物之后的新一代创新药物。寡核苷酸类药物是核酸药物中的代表。该寡核苷酸类药物包括：反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotide，ASO)、小干扰RNA(siRNA)和微小RNA(miRNA)等，寡核苷酸类药物大多由18～30个核糖寡核苷酸或脱氧核糖寡核苷酸组成，通过调控疾病基因的表达来治疗疾病。
[0003]对寡核苷酸类药物在样本中进行定量分析，尤其是生物样本(如血浆、细胞和组织)中的寡核苷酸类药物的定量分析，是药物研发和药效评估过程中的重要环节。
[0004]目前针对寡核苷酸类药物的定量分析方法主要包括：毛细管电泳。该方法虽然能对寡核苷酸进行定量分析，但需要对生物样本进行纯化和浓集预处理，即需要进行繁琐的预处理步骤才能进行后续的定量分析，这使得毛细管电泳无法直接对生物样本中的寡核苷酸类药物进行定量分析，这降低了寡核苷酸类药物的定量分析效率。

技术实现思路

[0005]本公开实施例提供了一种寡核苷酸类药物的定量分析方法，该定量分析方法无需进行繁琐的预处理就能够对寡核苷酸类药物进行定量分析，提高了寡核苷酸类药物的定量分析效率。所述技术方案如下：
[0006]本公开提供了一种寡核苷酸类药物的定量分析方法，所述定量分析方法包括：
[0007]根据待检测的寡核苷酸类药物的碱基序列制备第一探针和第二探针，所述第一探针包括第一序列段和第二序列段，所述第一序列段的3
’
端与所述第二序列段的5
’
端连接，所述第二探针包括第三序列段和第四序列段，所述第三序列段的3
’
端与所述第四序列段的5
’
端连接，待检测的寡核苷酸类药物的碱基序列分别与所述第二序列段和所述第三序列段互补配对；
[0008]制备正向引物和反向引物，所述正向引物与所述第一序列段序列一致，所述反向引物与所述第四序列段互补配对；
[0009]将待检测的所述寡核苷酸类药物的Ct值带入所述标准曲线，计算出所述待检测的所述寡核苷酸类药物的浓度；
[0010]将所述待检测的寡核苷酸类药物与所述第一探针和所述第二探针进行退火反应，得到待测双链；
[0011]向所述待测双链中加入连接酶进行连接反应，得到待测连接产物；
[0012]将所述待测连接产物作为模板利用所述正向引物和所述反向引物进行扩增反应，得到待检测的所述寡核苷酸类药物的Ct值，并设置空白对照组；
[0013]将待检测的所述寡核苷酸类药物的Ct值带入所述标准曲线，计算出待检测的所述寡核苷酸类药物的浓度。
[0014]具体地，所述寡核苷酸类药物的序列长度为2n，且n为正整数；
[0015]在制备所述第一探针和所述第二探针的过程中，所述第三序列段与所述寡核苷酸类药物的5
’
端至第n个碱基所对应的序列互补配对，所述第二序列段与所述寡核苷酸类药物的第n+1个碱基至所述寡核苷酸类药物的3
’
端所对应的序列互补配对。
[0016]具体地，所述寡核苷酸类药物的序列长度为2n+1，且n为正整数；
[0017]在制备所述第一探针和所述第二探针的过程中，所述第三序列段与所述寡核苷酸类药物的5
’
端至第n个碱基所对应的序列互补配对，所述第二序列段与所述寡核苷酸类药物的第n+1个碱基至所述寡核苷酸类药物的3
’
端所对应的序列互补配对；或者，
[0018]在制备所述第一探针和所述第二探针的过程中，所述第三序列段与所述寡核苷酸类药物的5
’
端至第n+1个碱基所对应的序列互补配对，所述第二序列段与所述寡核苷酸类药物的第n+2个碱基至所述寡核苷酸类药物的3
’
端所对应的序列互补配对。
[0019]具体地，所述连接酶为T4 DNA连接酶。
[0020]具体地，所述退火反应过程包括：65℃反应5min，起始温度60℃变温速率为0.1℃/s反应5min，起始温度55℃变温速率为0.1℃/s反应5min，起始温度50℃变温速率为0.1℃/s反应5min，起始温度45℃变温速率为0.1℃/s反应5min，起始温度40℃变温速率为0.1℃/s反应5min，起始温度35℃变温速率为0.1℃/s反应5min，起始温度30℃变温速率为0.1℃/s反应5min，起始温度25℃变温速率为0.1℃/s反应5min。
[0021]具体地，所述连接反应包括20℃反应10min，65℃反应10min。
[0022]具体地，所述定量分析方法还包括设置空白对照组，所述空白对照组将蒸馏水替代所述待测连接产物作为模板，利用所述正向引物和所述反向引物进行扩增，当空白对照组无Ct值时，或当标准品的Ct值与待检测的所述寡核苷酸类药物的Ct值均大于空白对照组的Ct值时，则将待检测的所述寡核苷酸类药物的Ct值带入所述标准曲线。
[0023]具体地，所述扩增反应过程包括：50℃反应2min，95℃反应2min，95℃反应15s，60℃反应15s，72℃反应1min，其中，95℃反应15s，60℃反应15s，72℃反应1min共循环40次。
[0024]具体地，所述扩增反应的反应体系包括：无核酸酶水、预混液、正向引物和反向引物以及所述标准品连接产物或所述待测连接产物。
[0025]具体地，所述扩增反应的反应体系还包括内标序列。
[0026]具体地，将所述标准品连接产物稀释104倍后用于扩增反应。
[0027]本公开实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本公开实施例提供了一种寡核苷酸类药物的定量分析方法，根据目标寡核苷酸设计两条特异性结合的探针，通过退火
‑
连接反应获得足够长度的核酸片段，然后利用正向引物和反向引物进行扩增反应对生物样本中目标寡核苷酸进行快速定量，该方法可直接对血浆生物样本中寡核苷酸类药物进行快速定量，无需对生物样本进行预处理，从而缩短了定量分析的时间，这大大提高了定量分析的效率。
附图说明
[0028]为了更清楚地说明本公开实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他
的附图。
[0029]图1是本公开实施例提供的标准曲线图。
具体实施方式
[0030]为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本公开实施方式作进一步地详细描述。
[0031]实施例
[0032]本公开实施例提供了一种寡核苷酸类药物的定量分析方法，该定量分析方法包括：
[0033]根据待检测的寡核苷酸类药物的碱基序列制备第一探本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种寡核苷酸类药物的定量分析方法，其特征在于，所述定量分析方法包括：根据待检测的寡核苷酸类药物的碱基序列制备第一探针和第二探针，所述第一探针包括第一序列段和第二序列段，所述第一序列段的3
’
端与所述第二序列段的5
’
端连接，所述第二探针包括第三序列段和第四序列段，所述第三序列段的3
’
端与所述第四序列段的5
’
端连接，待检测的寡核苷酸类药物的碱基序列分别与所述第二序列段和所述第三序列段互补配对；制备正向引物和反向引物，所述正向引物与所述第一序列段序列一致，所述反向引物与所述第四序列段互补配对；利用不同浓度的标准品绘制标准曲线；将所述待检测的寡核苷酸类药物与所述第一探针和所述第二探针进行退火反应，得到待测双链；向所述待测双链中加入连接酶进行连接反应，得到待测连接产物；将所述待测连接产物作为模板利用所述正向引物和所述反向引物进行扩增反应，得到待检测的所述寡核苷酸类药物的Ct值；将待检测的所述寡核苷酸类药物的Ct值带入所述标准曲线，计算出待检测的所述寡核苷酸类药物的浓度。2.根据权利要求1所述的定量分析方法，其特征在于，所述寡核苷酸类药物的序列长度为2n，且n为正整数；在制备所述第一探针和所述第二探针的过程中，所述第三序列段与所述寡核苷酸类药物的5
’
端至第n个碱基所对应的序列互补配对，所述第二序列段与所述寡核苷酸类药物的第n+1个碱基至所述寡核苷酸类药物的3
’
端所对应的序列互补配对。3.根据权利要求1所述的定量分析方法，其特征在于，所述寡核苷酸类药物的序列长度为2n+1，且n为正整数；在制备所述第一探针和所述第二探针的过程中，所述第三序列段与所述寡核苷酸类药物的5
’
端至第n个碱基所对应的序列互补配对，所述第二序列段与所述寡核苷酸类药物的第n+1个碱基至所述寡核苷酸类药物的3
’
端所对应的序列互补配对；或者，在制备所述第一探针和所述第二探针...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘小瑜，陈盛培，陈婉婷，谢禹鑫，
申请(专利权)人：深圳市硬核酸生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：