定量PCR方法及用于其的试剂盒技术

本发明专利技术提供经改良的定量PCR法(qPCR法)，其用于测定人细胞中的靶基因含量，能够例如在细胞疗法中以更高的精度分析细胞动力学。本发明专利技术的qPCR法包括下述步骤：将与靶基因不交叉的规定量的外源DNA作为用于校正靶基因的测定量的外标添加至含有人细胞的生物体试样中。的外标添加至含有人细胞的生物体试样中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】定量PCR方法及用于其的试剂盒


[0001]本专利技术涉及定量PCR(定量聚合酶链式反应，quantitative polymerase chain reaction：qPCR)法及用于其的试剂盒。更详细而言，本专利技术涉及用于在qPCR法中校正靶基因的定量结果的方法及用于实施该方法的试剂盒。

技术介绍

[0002]在施予基因工程化细胞的疗法、例如施予表达对特定肿瘤具有特异性的CAR(嵌合抗原受体)的T细胞(CAR
‑
T细胞)的细胞疗法中，把握施予后的细胞数在生物体内的动力学(细胞动力学)对于把握治疗效果及安全性(副作用)、建立恰当的治疗方针是重要的。
[0003]例如，非专利文献1中，记述了为了治疗急性成淋巴细胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia：ALL)及慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia：CLL)而施予Tisagenlecleucel(研发编号(code name)CTL019)、即含有靶向CD19阳性B细胞的CAR
‑
T细胞的制剂时的生物体内的细胞动力学。可期待所施予的CAR
‑
T细胞在生物体内增殖，能够持续保持一定的细胞数。对于该CAR
‑
T细胞的血液中的细胞数而言，其与作为治疗对象的ALL及CLL的症状呈相关性地变化，并认为其也与作为该制剂的毒性而可能引起的细胞因子释放综合征(CRS)的严重程度相关。因此，可认为对于这种制剂而言，CAR
‑/>T细胞的血液中细胞数的动力学是用于评价治疗效果和安全性这两个方面的重要信息。非专利文献1中，作为反映CAR
‑
T细胞数的指标，使用每1μg基因组DNA(gDNA)中的CAR
‑
T基因的拷贝数(拷贝/μg gDNA)。图1中示出该拷贝数于自细胞移植时(约103拷贝/μg gDNA)的数天急剧降低(约101拷贝/μg gDNA)，在此之后急剧上升(约104～106拷贝/μg gDNA)。
[0004]现有技术文献
[0005]非专利文献
[0006]非专利文献1：Mueller等，Blood 2017 130：2317
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2325；doi：https://doi.org/10.1182/blood
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2017
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06
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786129.

技术实现思路

[0007]专利技术所要解决的课题
[0008]以往，对于由血液等检体制备的生物体试样中的细胞数而言，如例如非专利文献1那样通过以该细胞的特异性基因为靶标的定量PCR(qPCR)法来以基因拷贝数的形式进行定量。此时，靶基因的拷贝数通常将基因组DNA(gDNA)作为内标(internal standard)，基于例如由基因组中的拷贝数众所周知的基因(例如RNaseP基因)的定量值换算而得的gDNA量进行标准化，使用例如“拷贝数/μggDNA”这样的单位表示为每单位量gDNA的拷贝数。
[0009]但是，迄今为止，尚未验证上述基于以往的定量方法的测定值、基于此测定值的细胞动力学是否适合作为用于评价细胞疗法的效果、安全性的指标。
[0010]本专利技术的课题为提供能够例如在细胞疗法中以更高的精度分析细胞动力学的改良qPCR法。
[0011]用于解决课题的手段
[0012]本申请专利技术人发现，对于根据以往的常规qPCR法将gDNA作为内标、使用“拷贝/μg gDNA”的单位表示的靶基因的测定值而言，从一些观点出发，可能不具有足以用作用于分析细胞疗法中所施予的CAR
‑
T细胞等的动力学的信息的准确性。
[0013]其原因在于，认为用于标准化的gDNA量会根据各种原因而发生较大的变化。例如，就细胞疗法中的gDNA量而言，在细胞疗法中，常规而言，患者在接受CAR
‑
T细胞等的移植前，为了提高该移植的效果，会接受使血液中的淋巴细胞耗竭的化疗。这种情况下，血液中的gDNA量也暂时性地显著减少，之后，随着淋巴细胞的恢复，gDNA量也增加。另外，增殖的CAR
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T也会引起gDNA量增加。因此，gRNA量在个人(患者)间、或来自同一个人但采集时期不同的生物体试样间(样品间)未必是恒定的，有可能变化、波动较大。若作为内标的gDNA量发生变化，则与假定gDNA量保持不变的情况相比，以相对于gDNA量的形式表示的靶基因的定量值(拷贝数/μggDNA)也会变化，有可能不会成为正确反映CAR
‑
T细胞在血液中的增殖、存活等的动力学的指标。
[0014]进一步，考虑靶基因的回收率的变化也会影响靶基因的拷贝数的定量值。即，来自DNA提取物的靶基因的回收率(相对于生物体试样中所含总DNA中含有的靶基因的正确的拷贝数而言的、从总DNA得到的提取物中含有的、且能够由qPCR扩增的靶基因的拷贝数的比率)也在生物体试样间变化，将gDNA量作为内标的情况下，可能无法充分缓和该靶基因回收率的变化的影响。
[0015]本申请专利技术人发现，通过在生物体试样中添加例如犬的gDNA这样的外源DNA、将此定量值用于标准化，能够获得上述针对靶基因拷贝数的各种影响得到抑制的更为准确的定量值，从而完成了本专利技术。上述本专利技术的qPCR法中，能够以每单位量的生物体试样(例如血液)的数值、例如使用“拷贝/μL血液”的单位表示的测定值的形式获得靶基因的拷贝数。
[0016]实际上，确认了如作为后述比较例1～3示出的那样、按照以往的qPCR法将gDNA作为内标的情况下，靶基因的定量值的准确率(Accuracy)较低，精密度(C.V.(变异系数，Coefficient of Variation))较大。相对于此，作为后述实施例1～6示出的根据本专利技术而使用外源DNA为外标(external standard)的情况下，标准基因(standard gene)的定量值的准确率及精密度较之上述以往的方法而言有明显的改善，由此确认了本专利技术的定量方法的有用性。例如，在使用模拟来自白细胞减少的患者的生物体试样(从健康人的血液中除去了白细胞)的样品的比较例3和实施例3的对比中，显示出了如上所述的本专利技术的优点。
[0017]因此，作为用于解决课题的手段，本专利技术提供以下的[1]～[6]。
[0018][1][0019]定量PCR法(qPCR法)，用于测定人细胞中靶基因的含量，所述qPCR法包括下述步骤：将与所述靶基因不交叉的规定量的外源DNA作为用于校正所述靶基因的测定量的外标添加至含有所述人细胞的生物体试样中。
[0020][2][0021]如项1所述的qPCR法，其中，所述qPCR法为实时PCR法，
[0022]所述靶基因的测定量的校正包括求出针对所述靶基因测得的Ct值与针对所述外源DNA测得的Ct值之差(ΔCt)、由此ΔCt换算为所述靶基因的量。
[0023][3][0024]如本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.定量PCR法(qPCR法)，其用于测定人细胞中靶基因的含量，所述qPCR法包括下述步骤：将与所述靶基因不交叉的规定量的外源DNA作为用于校正所述靶基因的测定量的外标添加至含有所述人细胞的生物体试样中。2.如权利要求1所述的qPCR法，其中，所述qPCR法为实时PCR法，所述靶基因的测定量的校正包括求出针对所述靶基因测得的Ct值与针对所述外源DNA测得的Ct值之差(ΔCt)、由所述ΔCt换算为所述靶基因的量。3.如权利要求1所述的qPCR法，其中，所述靶基因的测定量的校正包括反映回收率，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：松本真一，山本俊辅，后藤昭彦，福田美雪，平林英树，
申请(专利权)人：武田药品工业株式会社，
类型：发明
国别省市：