本发明专利技术涉及一种用于检测FGF19基因过表达的核酸组合物、试剂盒及其应用。具体地，所述核酸组合物包括FGF19基因的上游引物、FGF19基因的下游引物和FGF19基因的探针，其中，所述FGF19基因的上游引物选自以下至少之一：具有如SEQ ID NO:1所示的核酸序列、具有如SEQ ID NO:7所示的核酸序列、具有如SEQ ID NO:8所示的核酸序列和/或具有如SEQ ID NO:9所示的核酸序列，所述FGF19基因的下游引物具有如SEQ ID NO:2所示的核酸序列、具有如SEQ ID NO:10所示的核酸序列、具有如SEQ ID NO:11所示的核酸序列和/或具有如SEQ ID NO:12所示的核酸序列，所述FGF19基因的探针具有如SEQ ID NO:3所示的核酸序列。采用该核酸组合物能够直接定量检测FGF19基因的过表达倍数，实现只需普通的荧光定量PCR仪就能完成基因过表达的快速检测。测。测。
【技术实现步骤摘要】
一种用于检测FGF19基因过表达的核酸组合物、试剂盒及其应用
[0001]本专利技术涉及分子诊断
，特别涉及一种用于检测FGF19基因过表达的核酸组合物、试剂盒及其应用。
技术介绍
[0002]目前对于FGF19基因过表达的检测常采用的方法是夹心法酶联免疫吸附法(ELISA)，利用抗体与酶复合物结合显色的原理，最终通过判断颜色的深浅来评定样品中的FGF19的过表达情况。利用夹心法酶联免疫吸附法(ELISA)检测FGF19基因过表达存在以下缺陷：(1)操作复杂、费时费力，抗体成本较高；(2)准确度相对偏低，容易误检、漏检等，准确性和特异性较差、灵敏度低；(3)容易受交叉污染影响；(4)无法给出定量结果。
技术实现思路
[0003]本专利技术提供了一种用于检测FGF19基因过表达的核酸组合物、试剂盒及其应用，能直接定量检测FGF19基因的过表达倍数，通过标准化操作和数字化判读，避免了传统IHC/ELISA的一致性差和易产生主观误差的缺点，直接反映受检基因是否发生过表达情况，实现只需普通的荧光定量PCR仪就能完成基因过表达的快速检测。本专利技术以短片段扩增子设计方式，采用TaqMan探针法与MGB结合，并在设计探针时跨越了外显子与外显子，具有高灵敏度和高特异性。本专利技术过2
‑
ΔΔCt
的计算方式排除了内参与靶标检测时因扩增效率不同带来的误差，显著提高对基因过表达判定的准确性。本专利技术与现有技术相比具有如下优点：(1)基于荧光定量PCR技术，操作简单便捷、灵敏度高、特异性好、动态范围大、成本较低；(2)结果准确，无主观误差，并且全部反应都在封闭的反应管中完成，有效避免了可能的交叉污染。
[0004]在一方面，本专利技术提供了一种用于检测FGF19基因过表达的核酸组合物，其中，所述核酸组合物包括FGF19基因的上游引物、FGF19基因的下游引物和FGF19基因的探针，所述FGF19基因的上游引物具有如2
‑
ΔΔCt
所示的核酸序列，所述FGF19基因的下游引物具有如SEQ ID NO:2所示的核酸序列，所述FGF19基因的探针具有如SEQ ID NO:3所示的核酸序列。
[0005]在某些实施例中，所述核酸组合物进一步包括内参基因GAPDH的上游引物、内参基因GAPDH的下游引物和内参基因GAPDH的探针，所述内参基因GAPDH的上游引物具有如SEQ ID NO:4所示的核酸序列，所述内参基因GAPDH的下游引物具有如SEQ ID NO:5所示的核酸序列，所述内参基因GAPDH的探针具有如SEQ ID NO:6所示的核酸序列；引物探针设计采用短片段扩增子的设计方式，扩增子长度在50bp
‑
80bp，用于检测FGF19基因过表达的靶标和内参探针，设计位置跨越两个外显子，上下游引物分别在两侧的外显子。
[0006]在某些实施例中，所述FGF19基因的探针5
’
端标记荧光报告基团，3
’
端标记淬灭基团；优选地，所述FGF19基因的探针5
’
端标记FAM荧光报告基团，3
’
端标记MGB淬灭基团，
[0007]任选地，所述内参基因GAPDH的探针5
’
端标记荧光报告基团，3
’
端标记淬灭基团；
优选地，所述内参基因GAPDH的探针5
’
端标记VIC荧光报告基团，3
’
端标记MGB淬灭基团，探针3
’
端标记MGB淬灭基团，增加特异性。
[0008]在某些实施例中，所述核酸组合物包括具有如SEQ ID NO:1所示的核酸序列的所述FGF19基因的上游引物、具有如SEQ ID NO:2所示的核酸序列的所述FGF19基因的下游引物、具有如SEQ ID NO:3所示的核酸序列的所述FGF19基因的探针，具有如SEQ ID NO:4所示的核酸序列的所述内参基因GAPDH的上游引物、具有如SEQ ID NO:5所示的核酸序列的所述内参基因GAPDH的下游引物和具有如SEQ ID NO:6所示的核酸序列的所述内参基因GAPDH的探针，
[0009]在某些实施例中，所述FGF19基因的上游引物、所述FGF19基因的下游引物和所述FGF19基因的探针的摩尔比为10：4：5；
[0010]任选地，所述内参基因GAPDH的上游引物、所述内参基因GAPDH的下游引物和所述内参基因GAPDH的探针的摩尔比为6：10：5；
[0011]在另一方面，本专利技术提供了一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括上述的核酸组合物。
[0012]在某些实施例中，所述试剂盒还包括逆转录反应液(包含逆转录酶)、PCR反应液、酶混合液、ROX参比染料和无核酶水，
[0013]任选地，所述PCR反应液包括dNTPmix、MgCl2和缓冲液，
[0014]任选地，所述酶混合液包括Taq酶、酶保护剂。
[0015]在又一方面，本专利技术提供了上述的核酸组合物在制备试剂中的用途，所述试剂用于检测FGF19基因过表达。
[0016]在再一方面，本专利技术提供了一种检测FGF19基因过表达的方法，包括如下步骤：
[0017](1)提取待测样本和对照样本的RNA；
[0018](2)采用权利要求1～5中任一项所述的核酸组合物或者权利要求6或7中所述的试剂盒配制逆转录反应体系；
[0019](3)将步骤(2)中配制获得的逆转录反应体系进行逆转录反应；
[0020](4)将步骤(3)中获得的cDNA产物与权利要求1～5中任一项所述的核酸组合物或者权利要求6或7中所述的试剂盒配制PCR反应体系；
[0021](5)将步骤(4)中配制获得的PCR反应体系进行PCR反应；
[0022](6)将待测样本Ct值与对照样本Ct值按照2
‑
ΔΔCt
方式计算，得到待测样本中FGF19基因表达倍数。
[0023]在某些实施例中，步骤(2)中所述的PCR反应体系为：
[0024]成份加入量LunaScript RT SuperMix(5X)4ulRNA1ugGene specific primer mix(10μM)*2ul灭菌双蒸水To 20μL总体积20μL
[0025]*:Gene specific primer mix为FGF19、GAPDH引物对混和，配制方式如下表：
[0026]成份加入量
SEQ ID NO:1(10μM)2μLSEQ ID NO:2(10μM)2μLSEQ ID NO:4(10μM)2μLSEQ ID NO:5(10μM)2μL
[0027]任选地，步骤(3)中所述的逆转录反应的反应条件为：25℃2min、55℃10min、95℃1min。
[0028]在某些实施例中，步骤(4)中所述的PCR反应体系为：
[0029][0030][0031]其中，SEQ ID 本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于检测FGF19基因过表达的核酸组合物，其中，所述核酸组合物包括FGF19基因的上游引物、FGF19基因的下游引物和FGF19基因的探针，其中，所述FGF19基因的上游引物选自以下至少之一：具有如SEQ ID NO:1所示的核酸序列、具有如SEQ ID NO:7所示的核酸序列、具有如SEQ ID NO:8所示的核酸序列和/或具有如SEQ ID NO:9所示的核酸序列，所述FGF19基因的下游引物具有如SEQ ID NO:2所示的核酸序列、具有如SEQ ID NO:10所示的核酸序列、具有如SEQ ID NO:11所示的核酸序列和/或具有如SEQ ID NO:12所示的核酸序列，所述FGF19基因的探针具有如SEQ ID NO:3所示的核酸序列。2.根据权利要求1所述的核酸组合物，其中，所述核酸组合物进一步包括内参基因GAPDH的上游引物、内参基因GAPDH的下游引物和内参基因GAPDH的探针，所述内参基因GAPDH的上游引物具有如SEQ ID NO:4所示的核酸序列，所述内参基因GAPDH的下游引物具有如SEQ ID NO:5所示的核酸序列，所述内参基因GAPDH的探针具有如SEQ ID NO:6所示的核酸序列。3.根据权利要求1或2所述的核酸组合物，其中，所述FGF19基因的探针5
’
端标记荧光报告基团，3
’
端标记淬灭基团；优选地，所述FGF19基因的探针5
’
端标记FAM荧光报告基团，3
’
端标记MGB淬灭基团，任选地，所述内参基因GAPDH的探针5
’
端标记荧光报告基团，3
’
端标记淬灭基团；优选地，所述内参基因GAPDH的探针5
’
端标记VIC荧光报告基团，3
’
端标记MGB淬灭基团。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的核酸组合物，其中，所述核酸组合物包括具有如SEQ ID NO:1所示的核酸序列的所述FGF19基因的上游引物、具有如SEQ ID NO:2所示的核酸序列的所述FGF19基因的下游引物、具有如SEQ ID NO:3所示的核酸序列的所述FGF19基因的探针，具有如SEQ ID NO:4所示的核酸序列的所述内参基因GAPDH的上游引物、具有如SEQ ID NO:5所示的核酸序列的所述内参基因GAPDH的下游引物和具有如SEQ ID NO:6所示的核酸序列的所述内参基因GAPDH的探针，任选地，所述核酸组合物包括具有如SEQ ID NO:1所示的核酸序列的所述FGF19基因的上游引物、具有如SEQ ID NO:2所示的核酸序列的所述FGF19基因的下游引物和具有如SEQ ID NO:3所示的核酸序列的所述FGF19基因的探针。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的核酸组合物，其中，所述FGF19基因的上游引物、所述FGF19基因的下游引物和所述FGF...
【专利技术属性】
技术研发人员：濮悦，王涛，任文静，周焕焕，
申请(专利权)人：杭州瑞普基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。