一种构建TCR载体的方法技术

本申请公开了一种构建TCR载体的方法，包括如下步骤：骨架载体的构建：将TRBJ基因和TCR β链TRBC基因与骨架载体进行整合，得到含有TRBJ

【技术实现步骤摘要】
一种构建TCR载体的方法


[0001]本申请涉及TCR载体领域，尤其是涉及一种构建TCR载体的方法。

技术介绍

[0002]TCR指T细胞抗原受体，是可以赋予个体几乎是无限的抗原识别和应答能力的胚系基因，能够保证个体在多变环境中能和外来抗原(病原体)发生有效的免疫应答。
[0003]TCR由两条不同肽链构成的异二聚体，由α、β两条肽链组成，每条肽链又可分为可变区（V区），恒定区（C区），跨膜区和胞质区等几部分。其中α链包含TRAV基因、TRAJ基因、TRAC基因，β链包含TRBV基因、TRBJ基因、TRBC基因。构建质粒载体的时，需要将α链和β链用2A肽串联在一起，这些结构需要无缝连接在一起，即连接的部分表达产物不能出现多余的氨基酸，连接的方式如附图1所示。
[0004]目前常用的构建方法TCR载体的方法是基因合成TCR基因，再将基因片段通过同源重组或酶连接方法连接到载体上，合成费用高，时间也长。

技术实现思路

[0005]本申请提供了一种构建TCR载体的方法、骨架载体以及引物序列。
[0006]第一方面，一种构建TCR载体的方法，包括如下步骤：骨架载体的构建：构建包含TRBC基因的骨架载体；基因片段合成：基因合成EF1A
‑
TRAV基因片段、TRAC
‑
连接子基因片段和连接子
‑
TRBV基因片段；通过引物分别扩增所述EF1A
‑
TRAV基因片段、TRAC
‑
连接子基因片段和连接子
>‑
TRBV基因片段，将所述扩增的基因片段与所述骨架载体进行组装得到TCR载体。
[0007]在一些实施方案中，扩增的EF1A
‑
TRAV基因片段中的第一TRAJ基因子片段与TRAC
‑
连接子基因扩增片段中的第二TRAJ基因子片段可组成完整的TRAJ基因；连接子
‑
TRBV基因扩增产物中的第一TRBJ基因子片段与骨架载体中的第一TRBJ基因子片段可组成完整的TRBJ基因。
[0008]优选的，在进行组装时，采用TypeIIS内切酶和DNA连接酶对骨架载体进行切割及连接。在某些实施方案中，TypeIIS内切酶为BsmBI酶，连接酶为T4DNA连接酶。
[0009]优选的，所述步骤包括引物设计步骤，所述引物的设计包括：引入内切酶识别位点，在EF1A
‑
TRAV基因片段的下游引物的5
’
端引入第一TRAJ基因子片段，在连接子
‑
TRBV基因片段的下游引物的5
’
端引入第一TRBJ基因子片段。
[0010]优选的，所述骨架载体内含有CCDB自杀基因。
[0011]优选的，所述引物的5
’
端有TypeIIS内切酶的识别序列。
[0012]优选的，所述TRAC基因片段和TRBV基因片段之间存在连接片段，所述连接片段为自剪切肽的基因片段或IRES元件的基因片段。
[0013]优选的，所述自剪切肽的基因片段为编码P2A、T2A、E2A或F2A的基因序列中的任意
一种。
[0014]优选的，所述骨架载体包含以下序列的一种：SEQ ID Nos:48
‑
57。
[0015]优选的，所述TCR全长序列通过利用包含SEQ ID No:62、SEQ ID No:65和SEQ ID No:66的引物合成的。
[0016]在某些实施方案中，如图3所示，Primer1代表SEQ ID NO:62，Primer2代表SEQ ID No:65，Primer3代表SEQ ID No:66，其中，TypeIIS内切酶为BsmBI酶，BsmBI酶切割位点可以前后移动，位置不同，设计的引物序列会有少许变化。采用如下方式， Primer 1+Primer 2，Primer2 引物5撇端外挂第一TRAJ基因子片段序列，以EF1A
‑
TRAV为模板，可以扩增出EF
‑
1a+TRAV+TRAJ，片段包含完整的TRAV基因片段和第一TRAJ基因子片段。
[0017] Primer 3+Primer 4，Primer3引物5撇端外挂第二TRAJ基因子片段序列，以TRAC
‑
P2A为模板，可以扩增出TRAJ+TRAC+P2A，扩增片段包含完整的TRAC基因片段和第二TRAJ基因子片段，与EF
‑
1a+TRAV+TRAJ中的第一TRAJ基因子片段可拼接出完整的TRAJ基因。
[0018] Primer 5+Primer 6，Primer6 引物5撇端外挂第一TRBJ基因子片段序列，以P2A
‑
TRBV为模板，可以扩增出P2A+TRBV+TRBJ。扩增片段包含完整的TRBC基因片段和第一TRBJ基因子片段，这第一TRBJ基因子片段与骨架载体上的第二TRBJ基因子片段可拼接成完整的TRBJ基因。
[0019]这样设计将Primer 1、Primer4、Primer 5固定，根据目的TCR序列的TRAV、TRAJ、TRBJ的基因型，设计相应的Primer2、Primer3、Primer 6即可完成不同TCR载体的构建。最后在Primer 1
‑
6五撇端加上酶切识别位点。
[0020]第二方面，一种用于构建TCR载体的骨架载体，所述骨架载体包含以下序列的一种：SEQ ID Nos:48
‑
57。
[0021]第三方面，一种用于构建TCR载体的引物序列组，所述引物序列组包含SEQ ID No:62、SEQ ID No:65和SEQ ID No:66的序列。
[0022]综上所述，本申请具有如下有益效果：1.本申请采用先将具有固定序列的TRBC片段与含有CCDB自杀基因的骨架载体整合，获得可以提前制备的含有BC片段和CCDB自杀基因片段的骨架载体，预先合成EF1A
‑
TRAV基因，TRAC
‑
P2A基因和P2A
‑
TRBV基因；然后仅需3对引物，分别扩增得到TRAV到TRBV的基因片段，将三个扩增片段与骨架载体酶切连接，即可得到TCR载体。采用本申请的方法进行TCR载体的构建，连接部分不会出现多余的氨基酸；此外，本申请的TCR构建只需扩增三个基因片段，因此减少了合成的费用，节约了合成的时间。
附图说明
[0023]图1 载体中TCR序列的示意图。
[0024]图2 10个含有不同关键序列的骨架载体的部分结构示意图。
[0025]图3 TCR全长序列中引物切割位点的结构示意图，其中，TypeIIS内切酶切割位点，可以前后移动，位置不同，设计的引物序列会有少许变化。
具体实施方式
[0026]定义T细胞受体(TCR)是存在于T细胞表面的分子，其负责识别肽
‑
MHC复合本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建TCR载体的方法，其特征在于，包括如下步骤：构建包含TRBC基因的骨架载体；基因合成EF1A
‑
TRAV基因片段、TRAC
‑
连接子基因片段和连接子
‑
TRBV基因片段：通过引物分别扩增所述EF1A
‑
TRAV基因片段、TRAC
‑
连接子基因片段和连接子
‑
TRBV基因片段，将扩增的基因片段与所述骨架载体进行组装得到TCR载体。2.根据权利要求1所述的一种构建TCR载体的方法，其特征在于，扩增的EF1A
‑
TRAV基因片段中的第一TRAJ基因子片段与TRAC
‑
连接子基因扩增片段中的第二TRAJ基因子片段可组成完整的TRAJ基因；连接子
‑
TRBV基因扩增产物中的第一TRBJ基因子片段与骨架载体中的第二TRBJ基因子片段可组成完整的TRBJ基因片段。3.根据权利要求1所述的一种构建TCR载体的方法，其特征在于，所述引物的设计包括：引入内切酶识别位点，在EF1A
‑
TRAV基因片段的下游引物的5
’
端引入第一TRAJ...

【专利技术属性】
技术研发人员：矫士平，葛斌文，程伟，
申请(专利权)人：科士华南京生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：