一种床旁快速检测HPV的LAMP引物组、试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术公开了一种床旁快速检测HPV的LAMP引物组、试剂盒及其使用方法，属于生物检测技术领域。首先，提供用于检测的LAMP引物组，可有效保证检测特异性和灵敏度等；其次，将其应用于制备HPV检测试剂盒或试剂中，再经体系溶液组分的最佳配比的优化，将DNA提取和扩增合并为一步法，缩短LAMP反应时间，使总反应时间缩短至40min以内，同时，显示出较高的灵敏度和极好的特异性；最后，针对试剂盒，提供一种床旁快速检测HPV的试剂盒的使用方法，具体包括样本采集、裂解、扩增和判别等。此外，考虑到环境污染问题，发明专利技术人还特别设计密闭式废液收集腔，以达到消除污染的目的。以达到消除污染的目的。以达到消除污染的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种床旁快速检测HPV的LAMP引物组、试剂盒及其使用方法


[0001]本专利技术涉及一种HPV检测的引物组、试剂盒及其使用方法，尤其涉及一种床旁快速检测HPV的LAMP引物组、试剂盒及其使用方法，属于生物检测


技术介绍

[0002]人乳头瘤状病毒（HPV）是一种属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡DNA病毒，可在人体内广泛传播，持续感染可导致皮肤黏膜的赘生物、尖锐湿疣和宫颈癌等，因此，快速准确检测HPV对降低宫颈癌发病率具有极为重要的意义。传统的HPV检测方法包括：细胞组织病理学检测、阴道镜检测、电镜检测和宫颈荧光检查等，这些检测方法存在明显的缺点：灵敏度低、特异性差、不能对HPV进行分型，导致无法在临床上常规使用。目前，临床上常规的HPV检测方法主要是：实时荧光PCR、杂交捕获
‑
化学发光和PCR毛细电泳片段分析法等，但存在均需专业设备、专业人员操作，且耗时较长等缺点。
[0003]现有技术“CN110607399A，用于LAMP扩增以检测HPV和分型的引物组合、试剂盒和方法”中公开包含HPV16E6、HPV18E6、HPV31E6、HPV33E7、HPV35E6、HPV39E6、HPV45E7、HPV51E6E7、HPV52E6E7、HPV56E6、HPV58E6、HPV59E6、HPV66E6、HPV68E6和HPV73E6E7等LAMP扩增引物组，采用上述引物组合检测HPV的亚型，但该方法具有以下不足：（1）需要提取DNA，耗时2小时以上；（2）LAMP扩增反应1小时。
[0004]此外，“CN104805218A基于LAMP和分子信标检测HPV16和18的反应体系和方法”中仅检测了HPV16和HPV18，以及该方法存在以下缺点：(1)反应体系中含有分子信标探针，价格较高；（2）耗时久，超过60分钟；（3）LAMP反应后，需要在4℃、65℃和95℃条件下用紫外灯照射观察荧光，操作繁琐且需专业设备：紫外灯；“CN106148571A检测人乳头瘤病毒HPV16和HPV18的成套试剂”中检测时间较长，约1小时，且需紫外灯；“CN106939359A一种LAMP法检测HPV常见亚型的引物组及检测体系”中检测了HPV6、HPV11、HPV16、HPV42、HPV43和HPV44，涉及的检测方法耗时较长，超过1小时；需要专门设备，例如：荧光定量PCR仪、涡旋混合器、震荡型恒温金属浴、高速低温离心机、电泳仪、凝胶成像分析仪、流式点阵仪、实时浊度测定仪、电子分析天平、超纯水仪等；“CN110093459A用于快速检测13种高危型HPV的LAMP引物组合及应用”中耗时超过1小时，且在反应过程中，需要借助浊度仪检测浊度绘制“S”型曲线。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在克服现有技术的不足，而提出了一种床旁快速检测HPV的LAMP引物组、试剂盒及其使用方法。其中，专利技术人针对样本LAMP引物组、裂解液和反应体系开展了大量研发工作，筛选了特异性较强的LAMP引物组，以及优化了体系溶液组分的最佳配比，并将DNA提取和扩增合并为一步法，缩短LAMP反应时间，使总反应时间缩短至40min以内，同时，显示出较高的灵敏度和极好的特异性。此外，考虑到环境污染问题，专利技术人还特别设计密闭式废液收集腔，以达到消除污染的目的。
[0006]为了实现上述技术目的，提出如下的技术方案：
本技术方案提出：一种床旁快速检测HPV的LAMP引物组，包括如下核苷酸序列对组合：
[0007]进一步的，所述HPV包括亚型HPV16、HPV18、HPV33、HPV52、HPV56、HPV58和HPV68。
[0008]本技术方案提出：将所述LAMP引物组在制备HPV检测试剂中的应用。
[0009]本技术方案提出：将所述LAMP引物组在制备HPV检测试剂盒中的应用。
[0010]本技术方案提出：一种床旁快速检测HPV的试剂盒，包括所述LAMP引物组、裂解液和LAMP扩增体系，所述LAMP引物组总含量为1
‑
5μM；所述裂解液包括NaOH、Tris
‑
HCl、SDS、Triton
‑
X100、NP
‑
40和尿素，其中，NaOH为5
‑
20mM，Tris
‑
HCl为1
‑
5mM，SDS为0.05
‑
1%，Triton
‑
X100为0.1
‑
2%，NP
‑
40为1
‑
10%，尿素为2
‑
10mM，裂解液总体积为50μL；所述LAMP扩增体系包括：MgSO4、KCl、（NH4）2SO4、Tween
‑
20、betain、dNTPs、Bst3.0扩增酶和EVAgreen，其中，MgSO4为5
‑
10mM，KCl为25
‑
125mM，（NH4）2SO4为0
‑
40mM，Tween
‑
20为
0.01
‑
0.5%，betain为0.1
‑
0.25M，dNTPs为1
‑
5μM，Bst3.0扩增酶为0.2
‑
1.0U，EVAgreen为0.5
‑
1X，反应体系总体积为25μL。
[0011]优选的，所述LAMP引物组中，包括内引物浓度为1.6
‑
2.4μM，外引物浓度为0.1
‑
0.4μM，环引物浓度为0.4
‑
0.8μM。
[0012]优选的，所述裂解液包括5
‑
10mM的NaOH、1
‑
2mM的Tris
‑
HCl、0.05
‑
0.1%的SDS、0.5
‑
1%的Triton
‑
X100、1
‑
5%的NP
‑
40和4
‑
6mM的尿素。
[0013]优选的，所述LAMP扩增体系包括6
‑
7mM的MgSO4、75
‑
125mM的KCl、10
‑
20mM的（NH4）2SO4、0.1
‑
0.4%的Tween
‑
20、0.1
‑
0.25M的betain、1
‑
5μM的dNTPs、 0.5
‑
1X的EVAgreen和0.2
‑
1.0U 的Bst3.0扩增酶。
[0014]本技术方案还提出一种床旁快速检测HPV的试剂盒的使用方法，具体包括如下步骤：1）样本采集：采用包括但不限于阴道拭子或阴道细胞学刷头，进行样本采集；2）裂解：将离体的样本置于微流控核酸检测装置的加样室中，与预制的样本裂解液混合10min，得裂解液；其中，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种床旁快速检测HPV的LAMP引物组，其特征在于，包括如下核苷酸序列对组合：。2.根据权利要求1所述的床旁快速检测HPV的LAMP引物组，其特征在于，所述HPV包括亚型HPV16、HPV18、HPV33、HPV52、HPV56、HPV58和HPV68。3.权利要求1
‑
2中任意一项所述LAMP引物组在制备HPV检测试剂中的应用。4.权利要求1
‑
2中任意一项所述LAMP引物组在制备HPV检测试剂盒中的应用。5.一种床旁快速检测HPV的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1
‑
2中任意一项所述LAMP引物组、裂解液和LAMP扩增体系。6.根据权利要求5所述的床旁快速检测HPV的试剂盒，其特征在于，所述LAMP引物组总含量为1
‑
5μM；所述裂解液包括NaOH、Tris
‑
HCl、SDS、Triton
‑
X100、NP
‑
40和尿素，其中，NaOH为5
‑
20mM，Tris
‑
HCl为1
‑
5mM，SDS为0.05
‑
1%，Triton
‑
X100为0.1
‑
2%，NP
‑
40为1
‑
10%，尿素为2
‑
10mM，裂解液总体积为50μL；所述LAMP扩增体系包括：MgSO4、KCl、（NH4）2SO4、Tween
‑
20、betain、dNTPs、Bst3.0扩增酶和EVAgreen，其中，MgSO4为5
‑
10mM，KCl为25
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125mM，（NH4）2SO4为0
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40mM，Tween
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20为0.01
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0.5%，betain为0.1
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0.25M，dNTPs为1
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5μM，Bst3.0扩增酶为0.2
‑
1.0U，EVAgreen为0.5
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1X，反应体系总体积为25μL。7.根据权利要求5所述的床旁快速检测HPV的试剂盒，其特征在于，所述LAMP引物组中，包括内引物浓度为1.6
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2.4μM，外引物浓度为0.1
‑
0.4μM，环引物浓度为0.4
‑
0.8μM；所述裂解液包括5
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10mM的NaOH、1
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2mM的Tris
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HCl、0.05
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0.1%的SDS、0.5
‑
1%...

【专利技术属性】
技术研发人员：权利要求书二页说明书一五页附图一页，
申请(专利权)人：成都万众壹芯生物科技有限公司四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：