一种用于调控神经元活性的重组载体和方法技术

本发明专利技术属于神经科学中的神经调控领域，具体涉及一种用于调控神经元活性的重组载体和方法。本发明专利技术的重组载体携带有NALCN基因和/或THIK

【技术实现步骤摘要】
一种用于调控神经元活性的重组载体和方法


[0001]本专利技术属于神经科学中的神经调控领域，具体涉及一种用于调控神经元活性的重组载体和方法。

技术介绍

[0002]全身麻醉药物如何发挥麻醉作用，是一个基本的科学问题。吸入麻醉药在临床麻醉中广泛使用，现代麻醉的开端就源自于19世纪中叶吸入麻醉药的临床运用。吸入麻醉药物在临床相关浓度下可以产生镇静催眠、遗忘、意识消失及镇痛等作用，目前对于吸入麻醉药的具体作用机制尚不明了。普遍的观点认为吸入麻醉药通过抑制皮层
‑
皮层环路以及皮层
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丘脑环路发挥镇静催眠、可逆性意识消失的作用，通过抑制海马和外侧杏仁核发挥遗忘作用，通过作用于脊髓、脑干A5
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7神经核团以及中央区杏仁核发挥镇痛作用。其中，吸入麻醉药最重要的药理学作用即是可逆性的意识消失。尽管目前吸入麻醉药发挥意识消失作用的某些重要分子靶点已被确定，但是其发挥全麻作用的重要神经环路仍未完全了解。
[0003]目前研究神经环路的技术主要包括：电刺激、微透析或者微注射、光遗传学和化学遗传学。神经电刺激主要通过直接激活或抑制特定的脑区，以验证该脑区是否介导了特定性的行为和神经生理功能。微注射和微透析通过输注药物或其他物质来操控导管周围或探针尖端附近的神经元活动。但上述两种方法均不能调控特定类型的神经元。光遗传学通过选择性表达光敏感蛋白来激活或抑制特定的神经元或神经核团。但长时间光刺激会加热组织，从而引起与视蛋白激活或者抑制无关的神经生理作用。化学遗传学可以选择性激活或抑制特定脑区的特定神经元，且其配体可以全身给药，并可以提供长达数小时的持久效果。然而，化学遗传学的配体药物氯氮平
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N
‑
氧化物(CNO)会被代谢为具有镇静作用的抗精神病药氯氮平，可能干扰实验结果。此外，光遗传学和化学遗传学均是在采用外源性的方法(光照、药物)来改变神经元的兴奋性，从而间接研究神经核团或者神经环路对吸入麻醉药的敏感性，因此其均不能特异性的实现针对吸入麻醉药物靶点和神经核团，甚至神经环路的调节。
[0004]因此，目前仍然需要开发新的特异性调控技术，实现针对麻醉药物自身的全时空操控，能够针对特定神经元类型，可特异性的调控不同脑区和核团对吸入麻醉药的敏感性等目的，为麻醉药的重要靶点和神经环路的研究提供新的方法。
[0005]本专利技术团队既往的研究证实了NALCN(leak sodium channel)离子通道是吸入麻醉药的兴奋性调控神经元的靶点之一。基于Douglas等人近期的发现，异氟烷能通过抑制脑干斜方体后核THIK
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1样(TWIK
‑
related halothane
‑
inhibited K
+
)背景K
+
通道，激活RTN区神经元。由此可筛选出两个吸入麻醉药发挥兴奋性作用的靶点，即THIK
‑
1背景K
+
通道和NALCN背景Na
+
通道。
[0006]利用这些离子通道的活性与吸入麻醉药的兴奋性调控神经元之间的关系构建研究体系，实现吸入麻醉药调控中枢神经系统机理研究(例如确定吸入麻醉药的作用位点)不失为一种巧妙的思路。然而，利用这些离子通道的表达基因对神经元中离子通道的调节是
非常复杂的过程，其针对不同的神经元涉及到合适的启动子选择等问题，因而，目前通过离子通道的表达基因调控神经元中相应离子通道的活性，进而实现吸入麻醉药调控中枢神经系统机理研究体系尚未见到相关报道。

技术实现思路

[0007]针对现有技术的缺陷，本专利技术提供一种用于调控神经元活性的重组载体和方法，目的在于提供一种特异性调控系统，既可长时程操控，又可针对特定神经元类型，可特异性的调控不同脑区和核团对吸入麻醉药的敏感性，为研究吸入麻醉药的重要靶点和神经环路提供新的调控技术。
[0008]一种用于调控神经元活性的重组载体，所述重组载体携带有NALCN基因和/或THIK
‑
1基因；所述重组载体还携带有启动子，所述启动子选自CaMKII、mDlx、hSyn、SST、ChAT、NSE、Mecp2、hGFAP、c
‑
fos、GfaABC1D或EF1a中的至少一种。
[0009]优选的，所述重组载体带有荧光蛋白标记。
[0010]优选的，所述重组载体为慢病毒、腺病毒、腺相关病毒或质粒。
[0011]优选的，所述重组载体构建后为pLenti
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CaMKII
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EGFP
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P2A
‑
mNALCN
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pA(LTR)或AAV2/9
‑
CaMKII
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Kcnk13
‑
3xFlag
‑
P2A
‑
mCherry；
[0012]所述pLenti
‑
CaMKII
‑
EGFP
‑
P2A
‑
mNALCN
‑
pA(LTR)是在慢病毒CMV
‑
promoter、5'LTR序列和中央聚嘌呤序列后面分别插入CaMKII启动子、EGFP和P2A，在P2A后面插入mNALCN序列，在mNALCN序列后反向插入PA序列；
[0013]所述AAV2/9
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CaMKII
‑
Kcnk13
‑
3xFlag
‑
P2A
‑
mCherry是在AAV2 ITR序列后依次插入CaMKII启动子、Kcnk13 mRNA序列、重复的3个Flag序列、P2A序列、mCHerry荧光蛋白序列和PUC ori序列。
[0014]本专利技术还提供一种调控神经元活性的方法，它是将上述重组载体在体或者离体转染到神经元上，从而提高所述被转染神经元上NALCN离子通道和/或THIK
‑
1离子通道的表达水平。
[0015]所述载体调控神经元的活性，包括但不仅限于调控神经元上的Na
+
电导、K
+
电导。
[0016]NALCN离子通道在在体条件下常以通道复合体的形式存在，包括NALCN通道、UNC79、UNC80、FAM155A等。因此，所述载体调控神经元的活性，包括调控NALCN离子通道复合体的活性；本专利技术还提供一种动物模型，它是将上述载体在体转染到动物原本对麻醉药敏感的神经元后制成的。
[0017]优选的，将所述载体转染到动物的神经元的方法为注射。
[0018]优选的，所述神经元为原本对麻醉药敏感的神经元，所述原本对麻醉药敏感的神经元选自皮层锥体神经元或海马锥体神经元。
[0019]本专利技术还提供上述重组载体或上述动物模型用于麻醉药调控中枢神经系统机理研究的用途。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于调控神经元活性的重组载体，其特征在于：所述重组载体携带有NALCN基因和/或THIK
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1基因；所述重组载体还携带有启动子，所述启动子选自CaMKII、mDlx、hSyn、SST、ChAT、NSE、Mecp2、hGFAP、c
‑
fos、GfaABC1D或EF1a中的至少一种。2.按照权利要求1所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体带有荧光蛋白标记。3.按照权利要求1所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为慢病毒、腺病毒、腺相关病毒或质粒。4.按照权利要求1
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3任一项所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体构建后为pLenti
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CaMKII
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EGFP
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P2A
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mNALCN
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pA(LTR)或AAV2/9
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CaMKII
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Kcnk13
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3xFlag
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P2A
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mCherry；所述pLenti
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CaMKII
‑
EGFP
‑
P2A
‑
mNALCN
‑
pA(LTR)是在慢病毒CMV
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promoter、5'LTR序列和中央聚嘌呤序列后面分别插入...

【专利技术属性】
技术研发人员：周诚，阳垚鑫，邱静萱，张东航，欧梦婵，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：