一种荧光报告基因元件、基因编辑监测系统及其用途技术方案

本发明专利技术公开了一种荧光报告基因元件、基因编辑监测系统及用途。所述基因元件包括依次连接的第一编码区、第二编码区和第三编码区；所述第一编码区包括第一荧光蛋白报告基因，所述第二编码区包括第二荧光蛋白报告基因，所述第三编码区包括第三荧光蛋白报告基因；所述第一荧光蛋白报告基因、第二荧光蛋白报告基因和第三荧光蛋白报告基因分别位于不同的阅读框中，以使仅一种荧光蛋白能正确表达。本发明专利技术的基因元件通过对目标DNA编辑结果进行实时监控，能确定最佳的编辑时间窗；通过对不同荧光发光细胞数量统计完成对目标DNA编辑结果的预测。此外，还能通过建立人源化细胞模型，进行疾病的基因治疗新技术的评估。基因治疗新技术的评估。

【技术实现步骤摘要】
一种荧光报告基因元件、基因编辑监测系统及其用途


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种荧光报告基因元件、基因编辑监测系统及其用途。

技术介绍

[0002]自2013年CRISPR
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Cas9系统首次成功用于哺乳动物细胞基因编辑以来(Cong et al.,2013；Mali et al.,2013)，世界各国的科学家积极探索将该技术应用于基因功能研究和基因治疗领域(Gao et al.,2018；Kuscu et al.,2017；Lee et al.,2019；Levy et al.,2020；Li et al.,2018；Liang et al.,2017；Liu et al.,2018；Rossidis et al.,2018；Ryu et al.,2018；Song et al.,2020；Villiger et al.,2018；Zeng et al.,2018)。例如，通过CRISPR
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Cas9诱导的非同源末端连接(NHEJ)可人为地制造蛋白功能缺失，或通过密码子提前终止引起无义突变，上述针对基因的定向编辑，极大提升了对遗传学的认识(Shalem et al.,2014；Wang et al.,2013)。此外，NHEJ介导的阅读框改变也被用于纠正疾病细胞模型中的单基因遗传病(Roidos et al.,2020；Shen et al.,2018)。同时，CRISPR
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Cas9介导的生殖细胞基因治疗也被国内外少数科学家在人胚胎中进行了探索性研究(Liang et al.,2015；Ma et al.,2017)。
[0003]然而，研究显示，对固定的编辑靶点，CRISPR
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Cas9切割后的DNA修复并非随机的，而是有一定的偏好性(Allen et al.,2018；Anzalone et al.,2019；Chakrabarti et al.,2018；Long,2019；Shen et al.,2018；Shou et al.,2018；van Overbeek et al.,2016)。为此，科学家们开发了多种机器学习算法来选择最佳的编辑方案，包括FORECAT(Allen et al.,2018)、inDelphi(Shen et al.,2018)和Vienna Bioactivity CRISPR Score(VBC score){Michlits,2020#3229}以及其它一些机器学习模型(Chen et al.,2019)。然而，这些机器学习模型各自使用了不同的数据集进行训练，因此，各预测模型只适用于特定靶区基因编辑结局的预测。
[0004]为了克服上述缺陷，我们迫切需要建立一种通用的技术平台来简单、快速地进行基因编辑策略的临床前优化。
[0005]此外，在生殖系基因治疗方面，截至目前，人类的生殖细胞基因治疗因存在医学伦理问题而被全世界禁用，相关基因治疗技术的开发与建立均停留在研究阶段。有研究表明，在人胚胎进行相关的基因治疗时，胚胎中与疾病突变位点对应的同源等位基因会严重干扰基因治疗结果的统计(Adikusuma et al.,2018；Ma et al.,2017)，故CRISPR
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Cas9在人类生殖细胞基因治疗中的应用同样需要一个快速精准、无伦理风险的平台来优化基因治疗策略。

技术实现思路

[0006]鉴于以上原因，本专利技术的目的在于提供一种荧光报告基因元件、基因编辑监测系统及用途，用于解决现有技术应用中存在的问题。
[0007]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术是通过以下技术方案获得的。
[0008]本专利技术提供了一种针对基因编辑结果的细胞实时监控与评估系统，尤其是临床前活细胞，用于细胞(含体细胞和生殖细胞)基因编辑靶区筛选、策略优化及其对应“编辑时间窗”的确定，对提高基因编辑的精准性、降低脱靶率具有重要意义。该系统通过将与人疾病相关DNA片段以单拷贝的形式整合到细胞中建立人源化细胞模型，进行疾病相关的细胞基因治疗新技术的临床前评估，该人源化细胞或胚胎模型中单拷贝的特性，可有效避免人胚胎因致病突变相关同源基因对基因编辑结果分析的干扰，同时该系统还可以用于促进体细胞或生殖细胞精准基因编辑的药物的筛选工作。最后，该系统同样可用于锌指核酸酶(Zinc finger nucleases)(ZFNs)以及转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator
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like effector nucleases)(TALENs)基因编辑工具的靶区确定。
[0009]本专利技术的目的之一在于提供，一种荧光报告基因元件，所述基因元件包括依次连接的第一编码区、第二编码区和第三编码区；所述第一编码区包括第一荧光蛋白报告基因，所述第二编码区包括第二荧光蛋白报告基因，所述第三编码区包括第三荧光蛋白报告基因；所述第一荧光报告蛋白基因、第二荧光蛋白报告基因和第三荧光蛋白报告基因分别位于不同的阅读框中，以使仅一种荧光蛋白能正确表达。
[0010]优选地，所述基因元件还包括第一切割元件、第二切割元件、第三切割元件和第四切割元件；所述第一荧光蛋白报告基因和第一切割元件位于所述第一编码区，所述第二切割元件、第二荧光蛋白报告基因和第三切割元件位于所述第二编码区，所述第四切割元件和第三荧光蛋白报告基因位于所述第三编码区。
[0011]更优选地，所述第一切割元件和第二切割元件串联。更优选地，所述第一切割元件与所述第二切割元件通过11个碱基串联，使得第一切割元件位于第一编码区内以及第二切割元件位于第二编码区内，从而使得第一荧光蛋白报告基因翻译后与其相邻错位翻译的第二荧光蛋白实现有效切割。
[0012]更优选地，所述第三切割元件和第四切割元件串联。更优选地，所述第三切割元件与所述第四切割元件通过11个碱基串联，使得第三切割元件位于第二编码区内以及第四切割元件位于第三编码区内，从而使得第二荧光蛋白报告基因翻译后与其相邻错位翻译的第三荧光蛋白实现有效切割。
[0013]更优选地，所述第一切割元件、第二切割元件、第三切割元件和第四切割元件为2A肽段。
[0014]更优选地，所述第一切割元件、第二切割元件、第三切割元件和第四切割元件分别独立选自T2A肽段、P2A肽段、E2A肽段、F2A肽段、BmCPV2A肽段和BmIFV2A肽段中的一种。
[0015]进一步优选地，所述第一切割元件为T2A肽段，所述第二切割元件为T2A肽段，所述第三切割元件为T2A肽段，所述第四切割元件为P2A为肽段。
[0016]优选地，所述第一荧光蛋白报告基因、所述第二荧光蛋白报告基因和所述第三荧光蛋白报告基因之间互不相同。
[0017]所述互不相同是指，所述第一荧光蛋白报告基因不同于所述第二荧光蛋白报告基因，所述第二荧光蛋白报告基因不同于所述第三荧光蛋白报告基因，所述第一荧光蛋白报告基因不同于所述第三荧光蛋白报告基因。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种荧光报告基因元件，其特征在于，所述基因元件包括依次连接的第一编码区、第二编码区和第三编码区；所述第一编码区包括第一荧光蛋白报告基因，所述第二编码区包括第二荧光蛋白报告基因，所述第三编码区包括第三荧光蛋白报告基因；所述第一荧光蛋白报告基因、第二荧光蛋白报告基因和第三荧光蛋白报告基因分别位于不同的阅读框中，以使仅一种荧光蛋白能正确表达。2.如权利要求1所述的基因元件，其特征在于，所述基因元件还包括第一切割元件、第二切割元件、第三切割元件和第四切割元件；所述第一荧光蛋白报告基因和第一切割元件位于所述第一编码区，所述第二切割元件、第二荧光蛋白报告基因和第三切割元件位于所述第二编码区，所述第四切割元件和第三荧光蛋白报告基因位于所述第三编码区。3.如权利要求2所述的基因元件，其特征在于，包括如下技术特征中的至少一项：A1)所述第一切割元件与所述第二切割元件串联；A2)所述第三切割元件和所述第四切割元件串联；A3)所述第一荧光蛋白报告基因、所述第二荧光蛋白报告基因和所述第三荧光蛋白报告基因之间互不相同。4.如权利要求2所述的基因元件，其特征在于，包括如下技术特征中的至少一项：B1)所述第一编码区的上游连接有启动子；优选地，所述启动子为真核启动子；B2)所述第一荧光蛋白报告基因、所述第二荧光蛋白报告基因、所述第三荧光蛋白报告基因分别独立选自TopazYFP、mCherry、TagBFP、CFP、GFP和RFP中的一种；B3)所述第一切割元件、所述第二切割元件、所述第三切割元件和所述第四切割元件为2A肽段。5.如权利要求4所述的基因元件，其特征在于，包括如下技术特征中的至少一项：C1)所述启动子选自CMV或CAG；C2)所述第一...

【专利技术属性】
技术研发人员：索伦，吴海波，边雪娇，张硕，吕祁峰，匡延平，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属第九人民医院，
类型：发明
国别省市：