一种辅助带有CAR的慢病毒转染原代NK细胞的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种辅助带有CAR的慢病毒转染原代NK细胞的试剂盒及其应用。该试剂盒包括第一助感染剂、第二助感染剂、第三助感染剂、第四助感染剂；第一助感染剂为：聚凝胺终浓度为8～100mg/mL的水溶液；第二助感染剂为：白介素

【技术实现步骤摘要】
一种辅助带有CAR的慢病毒转染原代NK细胞的试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种辅助带有CAR的慢病毒转染原代NK细胞的试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]自然杀伤细胞(natural Killer cell，NK细胞)属于粒状淋巴细胞，是机体重要的免疫细胞，与非特异性免疫密切相关。作为一种广谱免疫细胞，NK细胞能能够分泌多种细胞因子以调节免疫应答，可直接杀伤某些肿瘤细胞和病毒感染细胞，在抗肿瘤和抗病毒感染以及免疫调节中起重要作用。有研究证明NK细胞的免疫原性以及对肿瘤的杀伤力均比T细胞高。
[0003]嵌合抗原受体(chemical antigen receptor，CAR)是可以识别特定蛋白(抗原)的细胞表面受体，其主要由两个结构域组成：胞外域和胞内信号转导区。当CAR结构与肿瘤相关抗原抗体融合表达在NK细胞的细胞膜表面时，能够赋予NK细胞特异性识别对应肿瘤细胞的能力，此时的NK细胞为即为常说的CAR
‑
NK细胞。
[0004]目前，肿瘤的细胞免疫治疗主要采用的是CAR
‑
T细胞，而CAR
‑
NK细胞的应用相对较少，这主要是由于NK细胞的转染难度较高，病毒的滴度较低，以及NK细胞难于感染，导致NK细胞的感染率较低，获得的总CAR
‑
NK细胞数量少，这限制了CAR
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NK细胞在肿瘤治疗方面的应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种辅助带有CAR的慢病毒转染原代NK细胞的试剂盒及其应用，以提高带有CAR的慢病毒对原代NK细胞的转染效率。
[0006]根据本专利技术的第一个方面，提供一种辅助带有CAR的慢病毒转染原代NK细胞的试剂盒，包括第一助感染剂、第二助感染剂、第三助感染剂、第四助感染剂；
[0007]第一助感染剂为：聚凝胺终浓度为8～100mg/mL的水溶液；
[0008]第二助感染剂为：白介素
‑
2(IL
‑
2)终浓度为500000～5000000U/mL、溶剂为0.3～0.7vol％人血清白蛋白的溶液；
[0009]第三助感染剂为：白介素
‑
12(IL
‑
12)终浓度为20000～200000U/mL、溶剂为0.3～0.7vol％人血清白蛋白的溶液；
[0010]第四助感染剂为：植物血凝素(Phytohaemagglutinin，PHA)终浓度为1～20mg/mL的水溶液。
[0011]本专利技术提供的辅助带有CAR的慢病毒转染原代NK细胞的试剂盒中含有四种助感染剂，分别含有聚凝胺、IL
‑
2、IL
‑
12和PHA，这几种物质协同作用能够提高带有CAR的慢病毒对原代NK细胞的转染效率，获得更多的CAR
‑
NK细胞。
[0012]优选地，上述辅助带有CAR的慢病毒转染原代NK细胞的试剂盒，包括第一助感染
剂、第二助感染剂、第三助感染剂、第四助感染剂；
[0013]第一助感染剂为：聚凝胺终浓度为80mg/mL的水溶液；
[0014]第二助感染剂为：白介素
‑
2终浓度为5000000U/mL、溶剂为0.5vol％人血清白蛋白的溶液；
[0015]第三助感染剂为：白介素
‑
12终浓度为200000U/mL、溶剂为0.5vol％人血清白蛋白的溶液；
[0016]第四助感染剂为：植物血凝素终浓度为10mg/mL的水溶液。
[0017]根据本专利技术的第二个方面，提供上述辅助带有CAR的慢病毒转染原代NK细胞的试剂盒在CAR
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NK细胞的制备中的应用。
[0018]根据本专利技术的第三个方面，提供一种CAR
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NK细胞的制备方法，包括以下步骤：
[0019](1)按照MOI＝2.5～20向原代NK细胞中加入带有CAR的慢病毒，然后加入第一助感染剂，培养5～7h，然后按照MOI值＝0～10向转染体系中加入带有CAR的慢病毒；
[0020](2)向上述转染体系中加入第二助感染剂、第三助感染剂、第四助感染剂，继续培养24～48h，得到CAR
‑
NK细胞；
[0021]第一助感染剂为：聚凝胺终浓度为8～100mg/mL的水溶液；
[0022]第二助感染剂为：白介素
‑
2终浓度为500000～5000000U/mL、溶剂为0.3～0.7vol％人血清白蛋白的溶液；
[0023]第三助感染剂为：白介素
‑
12终浓度为20000～200000U/ml、溶剂为0.3～0.7vol％人血清白蛋白的溶液；
[0024]第四助感染剂为：植物血凝素终浓度为1～20mg/mL的水溶液。
[0025]优选地，上述CAR
‑
NK细胞的制备方法中，第一助感染剂为：聚凝胺终浓度为80mg/mL的水溶液；
[0026]第二助感染剂为：白介素
‑
2终浓度为5000000U/mL、溶剂为0.5vol％人血清白蛋白的溶液；
[0027]第三助感染剂为：白介素
‑
12终浓度为200000U/mL、溶剂为0.5vol％人血清白蛋白的溶液；
[0028]第四助感染剂为：植物血凝素终浓度为10mg/mL的水溶液。
[0029]优选地，上述CAR
‑
NK细胞的制备方法中，步骤(1)为：按照MOI＝2.5～20向原代NK细胞中加入带有CAR的慢病毒，然后加入第一助感染剂，离心，培养5～7h，然后按照MOI值＝0～10向转染体系中加入带有CAR的慢病毒。
[0030]本方案在原代NK细胞中加入带有CAR的慢病毒后，加入第一助感染试剂，在培养前先进行离心，使得第一助感染剂能够与带有CAR的慢病毒、原代NK细胞混合充分，有利于带有CAR的慢病毒对原代NK细胞的转染，有效提高NK细胞的感染阳性率。
[0031]优选地，离心的条件为：30～37℃，800～1200g，0.5～5h。
[0032]优选地，上述CAR
‑
NK细胞的制备方法中，步骤(1)为：按照MOI＝2.5～10向原代NK细胞中加入带有CAR的慢病毒，然后加入第一助感染剂，培养5～7h，然后按照MOI值＝2.5～10向转染体系中加入带有CAR的慢病毒。
[0033]优选地，上述CAR
‑
NK细胞的制备方法中，步骤(1)为：按照MOI＝2.5～10向原代NK细胞中加入带有CAR的慢病毒，然后加入第一助感染剂，离心，培养5～7h，然后按照MOI值＝
2.5～10向转染体系中加入带有CAR的慢病毒。
[0034]本方案采用分步加入带有CAR的慢病毒的方式进行CAR
‑
NK细胞的制备，在按照MO本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种辅助带有CAR的慢病毒转染原代NK细胞的试剂盒，其特征在于：包括第一助感染剂、第二助感染剂、第三助感染剂、第四助感染剂；所述第一助感染剂为：聚凝胺终浓度为8～100mg/mL的水溶液；所述第二助感染剂为：白介素
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2终浓度为500000～5000000U/mL、溶剂为0.3～0.7vol％人血清白蛋白的溶液；所述第三助感染剂为：白介素
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12终浓度为20000～200000U/mL、溶剂为0.3～0.7vol％人血清白蛋白的溶液；所述第四助感染剂为：植物血凝素终浓度为1～20mg/mL的水溶液。2.如权利要求1所述辅助带有CAR的慢病毒转染原代NK细胞的试剂盒，其特征在于：包括第一助感染剂、第二助感染剂、第三助感染剂、第四助感染剂；所述第一助感染剂为：聚凝胺终浓度为80mg/mL的水溶液；所述第二助感染剂为：白介素
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2终浓度为5000000U/mL、溶剂为0.5vol％人血清白蛋白的溶液；所述第三助感染剂为：白介素
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12终浓度为200000U/mL、溶剂为0.5vol％人血清白蛋白的溶液；所述第四助感染剂为：植物血凝素终浓度为10mg/mL的水溶液。3.如权利要求1或2所述辅助带有CAR的慢病毒转染原代NK细胞的试剂盒在CAR
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NK细胞的制备中的应用。4.一种CAR
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NK细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)按照MOI＝2.5～20向原代NK细胞中加入带有CAR的慢病毒，然后加入第一助感染剂，培养5～7h，然后按照MOI＝0～10向转染体系中加入带有CAR的慢病毒；(2)向上述转染体系中加入第二助感染剂、第三助感染剂、第四助感染剂，继续培养24～48h，得到所述CAR
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NK细胞；所述第一助感染剂为：聚凝胺终浓度为8～100mg/mL的水溶液；所述第二助感染剂为：白介素
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2终浓度为500000～5000000U/mL、溶剂为0.3～0.7v...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾皓宇，沈振波，蒋碧愉，卫佳琦，杜越，
申请(专利权)人：广东普罗凯融生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：