诱导性分泌胰岛素的干细胞的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了诱导性分泌胰岛素的干细胞的制备方法及应用。目前临床上主要用重组胰岛素治疗胰岛素依赖性糖尿病。间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力，并且具有较强的免疫调节功能，对因自身免疫性损伤导致的胰岛功能降低有治疗作用。能响应葡萄糖浓度变化的诱导性分泌胰岛素型脐带间充质干细胞具有治疗糖尿病的广泛应用前景。病的广泛应用前景。病的广泛应用前景。

【技术实现步骤摘要】
诱导性分泌胰岛素的干细胞的制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及细胞生物学领域，特别是涉及诱导性分泌胰岛素的干细胞的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]糖尿病(diabetesmellitus，DM)是一组以长期血葡萄糖(简称血糖)水平增高为特征的代谢疾病群，是由遗传因素与环境因素共同作用引起的一种慢性高血糖状态。它是由于胰岛素分泌绝对和相对不足，导致糖代谢的紊乱，使血糖过高，出现尿糖，主要临床表现为多饮、多食、多尿、消瘦等症状。随着人口老龄化进程的加速，人民生活水平的提高，生活方式的改变，糖尿病的发病率迅速升高。目前全球DM患者已达40亿，WHO预测，到2030年，DM将占人类死亡顺位的第七位(Mathers CD，et al.(2006))。目前我国糖尿病的患病率在4％左右，糖尿病已经成为了仅次于心脑血管疾病和肿瘤之后的第三位威胁人类健康的慢性疾病，具有高致死率、高致残率和医疗花费高昂的特征，成为当前世界各国共同面对的公共健康问题。
[0003]I型糖尿病(Type 1 diabetes，T1D)是由于自身免疫反应导致胰岛β细胞损伤、胰岛素迅速、近乎完全的分泌缺乏；II型糖尿病(type 2 diabetes，T2D)则是由于胰岛素效应细胞对胰岛素的反应性降低，最初表现为胰岛素的分泌增加以维持血糖稳定，随着病程发展，最终胰岛β细胞衰竭、胰岛素的分泌也停止。
[0004]胰岛素是机体降低血糖的唯一激素。胰岛素的分泌分成两部分，一部分是维持空腹血糖正常而分泌的胰岛素，称为基础胰岛素，血浆基础胰岛素浓度为5～15μU/mL；另一部分则是为了降低餐后血糖升高、维持餐后血糖正常而分泌的胰岛素，称为餐时胰岛素。T1D患者在确诊糖尿病之前，大部分患者胰岛β细胞发生自身免疫性破坏，导致餐时和基础胰岛素分泌均减少。T2D患者胰岛β细胞功能异常进展缓慢，早期表现为外周胰岛素抵抗、高胰岛素血症、血糖正常，但是疾病晚期由于长期高血糖的毒性作用导致胰岛分泌功能下降、胰岛素分泌减少、空腹及餐后血糖均升高。
[0005]目前，临床上T1D的治疗主要采用外源性补充胰岛素的治疗方法，主要目的是控制血糖，但不能从根本上治疗糖尿病；并且频繁检测血糖、注射胰岛素增加了患者的心理生理负担；使用胰岛素泵虽可减少患者频繁注射的痛苦，但是会增加患者在仪器发生机械性/电子性故障时发生致死性意外的风险；另外长期使用外源性胰岛素注射易于产生胰岛素抗体、导致疗效降，而血糖控制不佳、慢性高血糖状态往往导致严重的合并症如心血管病变、视网膜病变、神经系统病变、肾功能衰竭等。除了胰岛素治疗，胰腺/胰岛移植是治疗T1D的有效方法之一。但是由于供体来源的限制和胰岛分离纯化技术的壁垒、将胰岛微胶囊化以降低免疫排斥、移植术后需终身服用免疫抑制剂以防止免疫排斥反应等问题限制了该项技术在临床的广泛应用(Scharp DW，Marchetti P.(2014))。因此，各国学者在不断地探索其他治疗方案，以此减轻患者痛苦、提高治疗效果。例如，研究者们研究了胚胎干细胞和诱导多能干细胞(iPSCs，Induced pluripotent stem cells)定向分化为胰岛β样细胞的可能性
和临床应用价值，但是胚胎干细胞的应用存在伦理学争议；iPSCs虽然可使用患者自身细胞诱导分化为胰岛β样细胞，但是自体β样细胞在T1D中仍可能受到自身免疫系统的攻击(Jeffrey R Millman，et al.(2017))。此外，β样细胞的体外增殖非常缓慢，如何高效高产的生产大量β样细胞也是临床应用需要考虑的首要问题(Jeffrey R Millman.et al.(2017))。
[0006]间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，是一种多能干细胞，具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化的能力。MSC最初在骨髓中发现，但是近年来发现脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UC
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MSCs)是骨髓MSCs的良好替代物。UC
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MSCs具有取材方便、简单、无痛苦；脐带中细胞数量丰富、增殖能力强(1份脐带可以培养超过100份细胞提供临床使用)；更接近胚胎干细胞，具有向内、中、外三个胚层的多种组织细胞分化的能力，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能；免疫原性低，并具有独特的免疫调节功能，可降低异常的免疫反应性；不涉及社会、伦理及法律争议等诸多优点，因而具有广泛的应用前景。
[0007]目前，体外诱导MSCs向胰岛β样细胞分化的技术已经比较成熟，分化后的胰岛β样细胞理论上可以分泌胰岛素进行T1D的治疗，但是随着MSCs的分化，各种细胞分化标志物，尤其是MHC分子也随之上调，回输体内后容易被人体的免疫系统识别、清除，而导致MSC移植失败(Swijnenburg RJ，et al.2005)；Drukker M，et al.(2002)；Beatriz Su
á
rez
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Alvarez，et al.(2010))，另外一个重要的问题是，UC
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MSCs向胰岛β样细胞分化的效率远远达不到临床所需数量的要求，该技术的临床应用转化困难。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是一种能响应血糖浓度变化的诱导性分泌胰岛素的UC
‑
MSCs的制备方法及其在胰岛素依赖型糖尿病的应用。
[0009]为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：
[0010]诱导性分泌胰岛素型UC
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MSCs制备方法，采用诱导性胰岛素启动子及胰岛素基因构建慢病毒载体，包装慢病毒后感染脐带间充质干细胞，得到所述的诱导性分泌胰岛素的UC
‑
MSCs；
[0011]所述诱导性胰岛素启动子及胰岛素基因的慢病毒载体是在慢病毒载体pCDH
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CMV
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MCS
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EF1
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Puro的多克隆位点插入序列如SEQ ID NO.1所示的诱导性分泌胰岛素的启动子以及如SEQ ID NO.2所示的信号肽+胰岛素基因核苷酸序列，获得诱导性分泌胰岛素基因的重组慢病毒载体pCDH
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glucose responsive Insulin Promoter
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Insulin。
[0012]本专利技术所用的细胞为UC
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MSCs。MSCs是来源于中胚层的多能干细胞，本专利技术使用的是来源于脐带的UC
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MSCs。诱导性胰岛素分泌型UC
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MSCs具有以下优势：(1)UC
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MSCs经过基因编辑后仍保持MSCs的特性，仍具有多向分化潜能，归巢、定植于胰岛局部的诱导性胰岛素分泌型UC
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MSCs可在胰岛局部的微环境诱导下有定向分化为胰岛β细胞的潜能，除了可作本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.诱导性分泌胰岛素的干细胞的制备方法及应用，其特征在于，通过将诱导性胰岛素启动子(glucose responsive Promoter)序列替换CMV启动子，其下游为胰岛素及其信号肽的核苷酸序列，构建的重组慢病毒载体质粒pCDH
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glucose responsive Promoter
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Insulin修饰P3代的脐带间充质干细胞，得到诱导性表达胰岛素的脐带间充质干细胞。2.如权利要求1所述的诱导性分泌胰岛素的干细胞的制备方法及应用，其特征在于，所述的诱导性胰岛素启动子序列为序列表SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列。3.如权利要求1所述的诱导性分泌胰岛素的干细胞的制备方法及应用，其特征在于，所述的胰岛素及其信号肽的核苷酸序列为序列表SEQ.ID.NO.2所示序列。4.如权利要求1所述的诱导性分泌胰岛素的干细胞的制备方法及应用，其特征在于，所述P3代的脐带间充质干细胞制备方法如下：取新生儿的脐带，分离出其中的华氏胶组织，剪碎至0.5mm...

【专利技术属性】
技术研发人员：王冰，李艳群，张伟涛，
申请(专利权)人：王冰，
类型：发明
国别省市：