磷酸吡哆醇合酶PdxJ突变体及其在制备维生素B6中的应用制造技术

本发明专利技术公开一种磷酸吡哆醇合酶PdxJ突变体及其在制备维生素B6中的应用。本发明专利技术在野生型磷酸吡哆醇合酶PdxJ的基础上引入特定位点的突变，通过在大肠杆菌中过表达磷酸吡哆醇合酶突变基因，其生产维生素B6的能力得到了大幅提高，具有较大的应用推广价值。具有较大的应用推广价值。具有较大的应用推广价值。

【技术实现步骤摘要】
磷酸吡哆醇合酶PdxJ突变体及其在制备维生素B6中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及磷酸吡哆醇合酶PdxJ突变体及其在制备维生素B6中的应用。

技术介绍

[0002]维生素 B6在药物、食品和饲料工业中具有广泛的应用，是人类或其他动物不可缺少的维生素，其包括三种天然形式：吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺，在体内以磷酸酯衍生物存在。维生素B6主要以活性形式磷酸吡哆醛参与近百种酶反应，其中多数与氨基酸代谢有关，例如转氨基、脱羧、脱水及转硫化反应等。
[0003]目前维生素B6的产品形式是吡哆醇盐酸盐，主要采用4
‑
甲基
‑5‑
乙氧基噁唑路线以化学法人工合成，中间体噁唑合成过程中用到强腐蚀性的三氯氧磷和有毒溶剂苯，反应控制难，潜在安全隐患大；制备工艺繁琐，能耗高，废水量大，废盐含量高，不利于环境保护，原子经济性差，产品成本高；另外，所得产品着色较重，精制工艺较为复杂等。生物制造过程具有原料无毒、反应过程温和、安全隐患小和环境友好等优点，因此维生素 B6的生物合成研究具有重大的科学意义和应用需求，是维生素 B6绿色工业化生产的一个必然趋势，经济效益和社会效益显著。
[0004]维生素B6的生物合成最初是Tazoe等人筛选了1590株菌株后发现，根瘤菌具有天然高产吡哆醇的能力，但产量较低（Tazoe M et al., Production of vitamin B
6 in Rhizobium. Biosci Biotechnol and Biochem, 1999; 63(8):1378
‑
1382.）。根瘤菌生长慢，生长周期较长，自身的遗传操作复杂，难以进行大规模的遗传研究，严重制约了根瘤菌作为底盘细胞进行维生素B6生产的研究。大肠杆菌，其遗传背景清晰，分子手段多样，是一种被广泛用作表达重要化学品的生产宿主。
[0005]本专利技术人前期对野生型大肠杆菌菌株MG1655进行了途径改造（ZL202110059483.2），以此为底盘细胞进一步探究其发酵生产维生素B6的能力。在大肠杆菌中，磷酸吡哆醇合酶（pyridoxine 5
‑
phosphate synthase =PdxJ）催化3
‑
磷酸羟基
‑1‑
氨基丙酮（PHA）和5
‑
磷酸脱氧核糖（DXP）生成5
‑
磷酸吡哆醇（PNP），其Kcat为= 0.07 s
‑1，Km=26.9 μM，Kcat/Km=0.002s
‑1μM
‑1，其催化常数远低于合成途径中的其它酶，因此磷酸吡哆醇合酶PdxJ的活性严重限制了维生素B6生物合成途径的催化效率，是维生素B6合成途径的限速酶，这大大限制了维生素B6发酵产量的提高。因此，急需提供一种具有较高活性的磷酸吡哆醇合酶用于提高维生素B6的生产。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的需求，本专利技术提供一种能够显著提高维生素B6的发酵产量的磷酸吡哆醇合酶PdxJ突变体。
[0007]本专利技术提供一种磷酸吡哆醇合酶PdxJ突变体，其氨基酸序列是以SEQIDNO:1所示的氨基酸序列为参考序列，在对应于SEQ ID NO：1的G7，I10，D11，I13，A19，G21，T22，A23，
V44，E100，V101，T103，E104，G194，T196，L212，N213，A217V，I218，I219位中的至少一个位置的氨基酸残基发生突变；或者所述磷酸吡哆醇合酶突变体的氨基酸序列具有所述发生突变的氨基酸序列中的所述突变位点，且与所述发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性、具有磷酸吡哆醇合酶活性的功能性片段，优选具有90％以上、95％以上或98％以上的同源性。
[0008]在本专利技术公开的一个实施方案中，所述磷酸吡哆醇合酶PdxJ突变体包括对应于SEQIDNO:1，发生如下位点的取代：G7L，I10L，D11N，I13V，A19Q，G21D，T22V，A23T，V44I，E100I，V101L，T103L，E104T，G194C，G194Q，T196C，T196V，T196M，A217V，L212I，N213I，I218L，I219G中的任一种或二种或三种或四种以上的组合：（1）所述的酶突变体是将SEQIDNO.1中的第11位的D置换为N，得到的蛋白质。
[0009]（2）所述的酶突变体是将SEQIDNO.1中的第13位的I置换为V，得到的蛋白质。
[0010]（3）所述的酶突变体是将SEQIDNO.1中的第103位的T置换为L，得到的蛋白质。
[0011]（4）所述的酶突变体是将SEQIDNO.1中的第196位的T置换为C，得到的蛋白质。
[0012]（5）所述的酶突变体是将SEQIDNO.1中的第212位的L置换为I，得到的蛋白质。
[0013]（6）所述的酶突变体是将SEQIDNO.1中的第217位的A置换为V，得到的蛋白质。
[0014]（7）所述的酶突变体是将SEQIDNO.1中的第103位的T置换为L，且第212位的L置换为I，得到的蛋白质。
[0015]（8）所述的酶突变体是将SEQIDNO.1中的第13位的I置换为V，且第196位的T置换为C，得到的蛋白质。
[0016]（9）所述的酶突变体是将SEQIDNO.1中的第104位的E置换为T，且第219位的I置换为G，得到的蛋白质。
[0017]（10）所述的酶突变体是将SEQIDNO.1中的第10位的I置换为L，且第212位的L置换为I，得到的蛋白质。
[0018]（11）所述的酶突变体是将SEQIDNO.1中的第10位的I置换为L，且第22位的T置换为V，得到的蛋白质。
[0019]（12）所述的酶突变体是将SEQIDNO.1中的第23位的A置换为T，第104位的E置换为T，且第212位的L置换为I，得到的蛋白质。
[0020]（13）所述的酶突变体是将SEQIDNO.1中的第13位的I置换为V，第104位的E置换为T，且第212位的L置换为I，得到的蛋白质。
[0021]（14）所述的酶突变体是将SEQIDNO.1中的第10位的I置换为L，第22位的T置换为V，且第23位的A置换为T，得到的蛋白质。
[0022]（15）所述的酶突变体是将SEQIDNO.1中的第104位的E置换为T，第196位的T置换为V，且第218位的I置换为L，得到的蛋白质。
[0023]（16）所述的酶突变体是将SEQIDNO.1中的第10位的I置换为L，第13位的I置换为V，且第212位的L置换为I，得到的蛋白质。
[0024]（17）所述的酶突变体是将SEQIDNO.1中的第13位的I置换为V，第100位的E置换为I，且第212位的L置换为I，得到的蛋白质。
[0025]（18）所述的酶突变体是将SEQIDNO.1中的第23位的A置换为T，第194位的G置本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种磷酸吡哆醇合酶PdxJ的突变体，其特征在于，所述磷酸吡哆醇合酶PdxJ突变体为如下(1)
‑
(34)中任一种：（1）SEQIDNO.1中的第11位的D置换为N；（2）SEQIDNO.1中的第13位的I置换为V；（3）SEQIDNO.1中的第103位的T置换为L；（4）SEQIDNO.1中的第196位的T置换为C；（5）SEQIDNO.1中的第212位的L置换为I；（6）SEQIDNO.1中的第217位的A置换为V；（7）SEQIDNO.1中的第103位的T置换为L，且第212位的L置换为I；（8）SEQIDNO.1中的第13位的I置换为V，且第196位的T置换为C；（9）SEQIDNO.1中的第104位的E置换为T，且第219位的I置换为G；（10）SEQIDNO.1中的第10位的I置换为L，且第212位的L置换为I；（11）SEQIDNO.1中的第10位的I置换为L，且第22位的T置换为V；（12）SEQIDNO.1中的第23位的A置换为T，第104位的E置换为T，且第212位的L置换为I；（13）SEQIDNO.1中的第13位的I置换为V，第104位的E置换为T，且第212位的L置换为I；（14）SEQIDNO.1中的第10位的I置换为L，第22位的T置换为V，且第23位的A置换为T；（15）SEQIDNO.1中的第104位的E置换为T，第196位的T置换为V，且第218位的I置换为L；（16）SEQIDNO.1中的第10位的I置换为L，第13位的I置换为V，且第212位的L置换为I；（17）SEQIDNO.1中的第13位的I置换为V，第100位的E置换为I，且第212位的L置换为I；（18）SEQIDNO.1中的第23位的A置换为T，第194位的G置换为C，且第219位的I置换为G；（19）SEQIDNO.1中的第104位的E置换为T，第194位的G置换为C，且第218位的I置换为L；（20）SEQIDNO.1中的第7位的G置换为L，第196位的T置换为C，且第217位的A置换为V；（21）SEQIDNO.1中的第23位的A置换为T，第44位的V置换为L，且第212位的L置换为I；（22）SEQIDNO.1中的第10位的I置换为L，第23位的A置换为T，且第104位的E置换为T；（23）SEQIDNO.1中的第10位的I置换为L，第101位的V置换为L...

【专利技术属性】
技术研发人员：张大伟，刘林霞，王岩岩，李金龙，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：