一种牛源抑制金黄色葡萄球菌溶血功能的单链抗体及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种牛源抑制金黄色葡萄球菌溶血功能的单链抗体及其制备方法和用途，涉及基因工程领域，本发明专利技术采用RT

【技术实现步骤摘要】
一种牛源抑制金黄色葡萄球菌溶血功能的单链抗体及其制备方法和用途


[0001]本专利技术涉及抗体药物领域，尤其涉及一种牛源抑制金黄色葡萄球菌溶血功能的单链抗体及其制备方法和用途。

技术介绍

[0002]单链抗体是一种基因工程抗体，通过DNA重组技术将抗体轻链可变区VL和重链可变区VH通过一段连接短肽linker首尾连接而成，是保留完整抗原结合部位的最小功能片段。单链抗体的表达形式主要有融合表达，胞内表达和分泌表达三种形式。和完整抗体相比，单链抗体具有以下优点：1)分子量小，大小仅为完整抗体的六分之一，免疫原性较低；2)组织穿透力强，容易进入实体瘤周围的微循环；3)血液清除快，肾脏蓄积很少；4)无Fc段，非特异结合低；5)易于通过基因工程大量生产；6)易于基因操作，更易构建重组免疫毒素。
[0003]奶牛乳腺炎是影响奶牛业发展，给乳品生产造成巨大损失的一种常见多发病。引起奶牛乳腺炎的致病菌很多，其中金黄色葡萄球菌是最重要的致病菌之一，流行率达到了50％，导致严重的经济损失。因为金黄色葡萄球菌具有传染性，且治疗用的抗生素易产生耐药性，所以很难彻底治愈。目前针对金黄色葡萄球菌全菌和多种毒力因子的疫苗也用于奶牛乳腺炎的预防，但是效果均不理想。单链抗体等基因工程抗体，以其独特的抗病毒和抗细菌作用及其能够大规模工程化制备的优势，显示了巨大的研发抗细菌药物的潜力，受到该领域高度重视。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种牛源抑制金黄色葡萄球菌溶血功能的单链抗体及其制备方法和用途，该单链抗体能够与金黄色葡萄球菌溶血性毒力因子(Hlb)特异性结合，且具有一定的抑制金黄色葡萄球菌Hlb溶血活性，能够用于金黄色葡萄球菌奶牛乳腺炎的研究。
[0005]本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0006]本专利技术首先提供一种牛源抑制金黄色葡萄球菌溶血功能的单链抗体，包括轻链可变区VL、重链可变区VH、连接肽Linker，并按照VL
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Linker
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VH的顺序连接构成牛源单链抗体片段VL
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Linker
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VH，所述体轻链可变区VL氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述重链可变区VH氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0007]进一步地，所述牛源单链抗体片段VL
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Linker
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VH氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0008]本专利技术的第二个方面是提供一种抑制奶牛乳腺炎的药物，该药物包括所述牛源抑制金黄色葡萄球菌溶血功能的单链抗体。
[0009]本专利技术的第三个方面是提供一种奶牛乳腺炎诊断试剂盒，其特征在于包括所述单链抗体，或者编码所述单链抗体的基因片段以及与之交联的探针。
[0010]本专利技术的第四个方面是提供牛源抑制金黄色葡萄球菌溶血功能的单链抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0011]步骤1、扩增轻链可变区VL基因和重链可变区VH基因
[0012]采用RT
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PCR从患奶牛乳腺炎的外周血单个核细胞RNA中扩增出抗体编码基因的轻链可变区VL基因和重链可变区VH基因；
[0013]步骤2、合成scFv基因
[0014]利用SOE
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PCR法将中间连接肽linker、VH基因、VL基因相连，构建牛源性单链抗体基因，即scFv基因；
[0015]步骤3、构建重组表达质粒
[0016]将scFv基因和噬菌粒载体酶切后，构建重组表达质粒；
[0017]步骤4、建立初级单链抗体文库
[0018]将重组表达质粒转化入宿主细胞，培养并用辅助噬菌体扩增建立初级单链抗体文库；
[0019]步骤5、用原核表达的金黄色葡萄球菌Hlb蛋白作为包被抗原，富集淘选3～5轮，得到克隆；优选地，富集淘选4轮，得到克隆；
[0020]步骤6、采用phage ELISA筛选,用原核表达的金黄色葡萄球菌Hlb蛋白作为包被抗原，筛选阳性克隆；
[0021]步骤7、构建单链抗体原核表达质粒
[0022]将筛选得到的阳性克隆酶切，回收单链抗体Hlb
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scFv
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1编码基因，与同步酶切的原核表达载体pET32a(+)混匀后，14～16℃连接过夜，连接产物转化DH5α感受态细胞后，挑取单克隆，菌落PCR和质粒双酶切验证正确的克隆进行测序；
[0023]步骤8、构建单链抗体原核表达质粒的菌株
[0024]将步骤7得到的测序正确的第一单克隆的重组质粒进行提取，获得第一重组质粒，将第一重组质粒转化到BL21感受态细胞后，挑取第二单克隆，对第二单克隆的菌落PCR扩增和提取第二质粒；第二单克隆的菌落PCR扩增产物和第二质粒分别经双酶切验证，对于经验证正确的第二单克隆进行测序，得到测序正确的第二单克隆；测序正确的第二单克隆中提取的质粒为构建成的单链抗体原核表达质粒pET32a
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Hlb
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scFv
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1，将第二单克隆菌落pET32a
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Hlb
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scFv
‑1‑
BL21传代纯化，保存备用；
[0025]步骤9、表达纯化单链抗体蛋白
[0026]将步骤8构建成单链抗体原核表达质粒的菌株pET32a
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Hlb
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scFv
‑1‑
BL21在37℃培养，当细菌OD值为0.4～0.6时，加入0.6mM蛋白质诱导剂IPTG，在28℃进行诱导表达16
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20h后，对单链抗体蛋白进行纯化。
[0027]优选地，步骤2中所述scFv基因按照VL
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Linker
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VH的顺序连接。
[0028]优选地，所述抗体可变区VL和重链可变区VH氨基酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示，scFv氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，所述中间连接肽氨基酸序列为(GGGGGSGGGGS)，轻、重链的正反向引物分别为VL F、VL R、VH F和VH R，核苷酸序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示，VLF、VH R分别含有SfiI和NotI酶切位点，VH F、VL R含互补的Linker序列，步骤7中所述菌落PCR引物分别为VL
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F、VH
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R，核苷酸序列如SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示。
[0029]优选地，所述噬菌粒载体为pCANTAB5E。进一步优化，步骤3中，所述酶切位点为Sfi I和Not I，其中Sfi I：GGCCCAGCCGGCC，Not I：GCGGCCGC。
[0030]优选地，步骤7中，与pET32a(+)载体连接时，优选的酶切位点为EcoRI和XhoI本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种牛源抑制金黄色葡萄球菌溶血功能的单链抗体，其特征在于，包括轻链可变区VL、重链可变区VH、连接肽Linker，并按照VL
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Linker
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VH的顺序连接构成牛源单链抗体片段VL
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Linker
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VH，所述轻链可变区VL氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述重链可变区VH氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。2.根据权利要求1所述的牛源抑制金黄色葡萄球菌溶血功能的单链抗体，其特征在于，所述牛源单链抗体片段VL
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Linker
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VH氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。3.一种抑制奶牛乳腺炎的药物，其特征在于，该药物包括权利要求1或2所述的牛源抑制金黄色葡萄球菌溶血功能的单链抗体。4.一种用于金黄色葡萄球菌的试剂盒，其特征在于包括权利要求1或2的牛源抑制金黄色葡萄球菌溶血功能的单链抗体，或编码所述牛源抑制金黄色葡萄球菌溶血功能的单链抗体的基因片段以及与之交联的探针。5.一种牛源抑制金黄色葡萄球菌溶血功能的单链抗体，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、扩增轻链可变区VL基因和重链可变区VH基因采用RT
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PCR从患奶牛乳腺炎的外周血单个核细胞RNA中扩增出抗体编码基因的轻链可变区VL基因和重链可变区VH基因；步骤2、合成scFv基因利用SOE
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PCR法将中间连接肽linker、VH基因、VL基因相连，构建牛源性单链抗体基因，即scFv基因；步骤3、构建重组表达质粒将scFv基因和噬菌粒载体酶切后，构建重组表达质粒；步骤4、建立初级单链抗体文库将重组表达质粒转化入宿主细胞，培养并用辅助噬菌体扩增建立初级单链抗体文库；步骤5、用原核表达的金黄色葡萄球菌Hlb蛋白作为包被抗原，富集淘选；步骤6、采用phage ELISA筛选,用原核表达的金黄色葡萄球菌Hlb蛋白作为包被抗原，筛选阳性克隆；步骤7、构建单链抗体原核表达质粒将筛选得到的阳性克隆酶切，回收单链抗体Hlb
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scFv
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1编码基因，与同步酶切的原核表达载体pET32a(+)混匀后，14～16℃连接过夜，连接产物转化DH5α感受态细胞后，挑取单克隆，菌落PCR和质粒双酶切验证正确的克隆进行测序；步骤8、构建单链抗体...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱建国，程曼玲，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：