一种抗脆弱拟杆菌毒素蛋白前体的特异性纳米抗体Nb2.82及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗脆弱拟杆菌毒素蛋白前体的特异性纳米抗体Nb2.82及其应用，通过深入研究肿瘤患者产肠毒素脆弱拟杆菌和其产生的脆弱拟杆菌毒素蛋白，采用噬菌体展示技术对脆弱拟杆菌毒素蛋白前体(BFT

【技术实现步骤摘要】
一种抗脆弱拟杆菌毒素蛋白前体的特异性纳米抗体Nb2.82及其应用


[0001]本专利技术属于生物制药
，涉及一种抗脆弱拟杆菌毒素蛋白前体(B.fragilis toxin以下简称BFT
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sFL)的特异性纳米抗体，该抗体与BFT的活性短氨基酸结合位点结合，具体涉及一种抗脆弱拟杆菌毒素蛋白前体的特异性纳米抗体Nb2.82及其应用。

技术介绍

[0002]脆弱拟杆菌(B.fragilis)是拟杆菌属中最常见的模式种，也是所有临床分离厌氧菌株中最常见拟杆菌种。根据是否产毒素，脆弱拟杆菌可分为产肠毒素脆弱拟杆菌(Enterotoxigenic Bacteroides fragilis,ETBF)和不产肠毒素脆弱拟杆菌(Non
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toxigenic Bacteroides fragilis,NTBF)。对脆弱拟杆菌群进行抗菌药物敏感性测定和耐药机制研究发现，临床分离脆弱拟杆菌群菌株对甲硝唑和氯霉素最为敏感，但对碳青霉烯类在内的抗菌药出现多重耐药，且耐药率及耐药基因携带率高于其他国家和我国既往研究报道，应引起临床高度关注。在其治疗方法中，抗生素是目前采取的主要手段，抗生素治疗可以使机体产生耐药性，还会对人体内的有益菌造成损伤。
[0003]ETBF可以重塑细菌群落以增强其自身的诱导能力以及选择性地“排挤”有益微生物物种。其中ETBF和产生遗传毒素的pks+大肠杆菌可以共同促进家族性腺瘤性息肉病(FAP)患者肿瘤的形成。研究发现，ETBF在结直肠癌患者肠道内的富集量明显高于健康人群，在结直肠癌患者中的检出率随结直肠癌的肿瘤分期的增大而增加。Purcell RV等人在对150位接受结肠镜检查的病人进行追踪，发现约有80％初次镜检携带ETBF的病人在12
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15年后患有癌前病变，ETBF的定植可能是早期大肠癌发生的潜在标志。
[0004]脆弱拟杆菌毒素(B.fragilis toxin，BFT)是ETBF的毒性来源，具有很强的活性和毒性，BFT是一种大小约为20kDa的含锌蛋白酶。包括三种亚型，分别由bft1、bft2、bft3三种等位基因编码，三种等位基因具有高度同源性，碱基序列89％～94％相同。BFT共由397个氨基酸残基组成，包括含有18个氨基酸残基的信号肽，含有193个氨基酸残基的前肽区和186个氨基酸残基的催化活性区。其中BFT2毒性最强，BFT1分布最广，BFT3似乎仅分布在东南亚地区。BFT基因由6kb的致病性岛BfPAI编码，只包含编码BFT的bft基因和编码另一种金属蛋白酶基因mpII，部分ETBF可存在双拷贝致病岛基因。
[0005]ETBF菌株的体外检测手段主要分为四种：第一种是PCR检测，即从粪便中提取DNA对bft基因进行检测，但是粪便中含有大量Taq聚合酶的抑制物质,因此提取的DNA扩增效果不佳。第二种是通过HT29/C1细胞形态学观察，利用BFT能改变肠上皮细胞形态的特性。BFT的毒性作用会使细胞变圆、细胞簇散裂。但是该方法成本高，需要大量劳动力，而且还需要厌氧微生物学专业知识和HT29/C1细胞分析的主观解释。第三种方法是使用酶联免疫吸附法(ELISA)检测
[12]，使用BFT多克隆抗体作为抗原。第四种方法是通过免疫磁性分离技术(IMS
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PCR)检测，为了更高的灵敏度该方法需要两种脆弱拟杆菌抗体，其中的一种抗体还遗
失了。与此同时，传统抗体在鉴定过程中由于其稳点性差、产量低、纯度低和成本高等缺点，故而不能广泛使用。纳米抗体分子量小，稳定性强、抗酸碱性强、热稳定好，成本低廉，可以克服普通抗体的以上缺点。因此，建立以纳米抗体为探针的新型、快速、准确和灵敏的诊断方法，是评估ETBF流行病学及其疾病相关性的关键，同时也是ETBF疾病治疗试验的重要前提。

技术实现思路

[0006]为了克服上述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种抗脆弱拟杆菌毒素蛋白前体的特异性纳米抗体Nb2.82及其应用。
[0007]为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：
[0008]本专利技术公开了一种抗脆弱拟杆菌毒素蛋白前体的特异性纳米抗体Nb2.82，该特异性纳米抗体Nb2.82的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0009]优选地，该特异性纳米抗体Nb2.82的重链包括4个框架区FR1～FR4，以及3个抗原互补决定区CDR1～CDR3；其中：
[0010]所述4个框架区FR1～FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8所示；
[0011]所述3个抗原互补决定区CDR1～CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7所示。
[0012]本专利技术还公开了一种核酸，编码权利要求1所述的抗脆弱拟杆菌毒素蛋白前体的特异性纳米抗体Nb2.82，该核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示。
[0013]本专利技术还公开了一种原核表达载体，含有上述的核酸。
[0014]本专利技术还公开了一种原核宿主细胞，含有上述的原核表达载体。
[0015]本专利技术还公开了一种突变体，是以上述的抗脆弱拟杆菌毒素蛋白前体的特异性纳米抗体Nb2.82为模板，经随机突变、点突变或双特异性抗体改造，获得的特异性或靶向性增强的突变体。
[0016]本专利技术还公开了上述的抗脆弱拟杆菌毒素蛋白前体的特异性纳米抗体Nb2.82、核酸、原核表达载体、原核宿主细胞或突变体在制备抗脆弱拟杆菌毒素蛋白吸附剂中的应用。
[0017]本专利技术还公开了上述的抗脆弱拟杆菌毒素的特异性纳米抗体Nb2.82、核酸、原核表达载体、原核宿主细胞或突变体在制备脆弱拟杆菌毒素的检验试剂中的应用。
[0018]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0019]本专利技术通过深入研究抗脆弱拟杆菌毒素蛋白前体(BFT
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sFL)，采用噬菌体展示技术对BFT
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sFL纳米抗体进行表达，并通过生物淘筛技术筛选出与抗原具有较高结合力的纳米抗体，称为Nb2.82，该纳米抗体Nb2.82为抗脆弱拟杆菌毒素的特异性纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本专利技术通过实验表达并优化获得亲和力高且稳定均一的BFT
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sFL纳米抗体蛋白即Nb2.82，开辟检验人肠道细菌产肠毒素脆弱拟杆菌和脆弱拟杆菌毒素的新领域，具有良好的研究价值和应用前景。
附图说明
[0020]图1为BFT
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sFL毒素蛋白质结构示意图；
[0021]图2为BFT1
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sFL抗原重组蛋白纯化图；其中，(a)为经凝胶过滤层析柱Superdex75PG纯化后的蛋白结果图(b)为蛋白电泳结果；
[0022]图3用ELISA方法评价免疫效果图；
[0023]图4为用PCR方法随机挑取20个菌落计算插本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗脆弱拟杆菌毒素蛋白前体的特异性纳米抗体Nb2.82，其特征在于，该特异性纳米抗体Nb2.82的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.根据权利要求1所述的抗脆弱拟杆菌毒素蛋白前体的特异性纳米抗体Nb2.82，其特征在于，该特异性纳米抗体Nb2.82的重链包括4个框架区FR1～FR4，以及3个抗原互补决定区CDR1～CDR3；其中：所述4个框架区FR1～FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8所示；所述3个抗原互补决定区CDR1～CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7所示。3.一种核酸，其特征在于，编码权利要求1所述的抗脆弱拟杆菌毒素蛋白前体的特异性纳米抗体Nb2.82，该核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑芳，温玉荣，郭玉呈，
申请(专利权)人：陕西海司诺维科技有限公司，
类型：发明
国别省市：